Titlu proiectului

Acronimul proiectului

LIPIDERI

Arie tematica

IV - Sanatate

Rezumatul proiectului

Diabetul de tip 2 (D2T) si sindromul metabolic (SM) sunt maladiile majore ale prezentului, ce au capatat proportii epidemice in intreaga lume. Morbiditatea asociata diabetului (pierderile de vedere, scleroza renala, amputarea piciorului) implica costuri socio-economice importante. In plus, exista astazi o crestere alarmanta a numarului de copii care sufera de D2T. Rezistenta la insulina (RI) este asociata cu D2T si SM. Scopul acestui studiu este de a stabili mecanisme prin care dislipidemia induce RI. Obiectivele urmarite sunt: identificarea factorilor cheie in acumularea de lipide; legatura dintre actiunea insulinei si hiperlipidemia postprandiala; cauza bolii ficatului gras si dezvoltarea reactiilor inflamatorii; noi medicamente si produse nutraceutice pentru stoparea RI cauzata de dislipidemie. Pentru realizarea acestor obiective propunem urmatoarele metode si modele experimentale: 1) dozari biochimice pentru caracterizarea pacientilor cu RI; 2) celule in cultura pentru evaluarea mecanismelor prin care lipoproteinele glicate induc RI si rolul lor in procesul inflamator; 3) biologia moleculara pentru identificarea cailor de semnalizare implicate in reglarea receptorilor celulari; 4) citometria de flux pentru estimarea stresului oxidativ; 5) un model animal de RI indusa prin dieta hiperlipidemica; 6) testarea efectului unor medicamente (fibrati, tocoferol) si unor compusi nutraceutici pe model animal si celulea implicate in RI. Rezultatele vor fi corelate cu datele clinice furnizate de parteneri si vor contribui la: (a) progresul cercetarii fundamentale a mecanismelor generatoare de RI, (b) identificarea unor markeri moleculari ce vor permite depistarea timpurie a pacientilor cu risc RI; (d) evidentierea unor tinte moleculare cu potential terapeutic. In ansamblul sau, proiectul isi propune elaborarea unor metode de investigaţie şi intervenţionale bazate pe medicina moleculară şi celulară, genomică şi proteomică pentru prevenirea dislipidemiei generatoare de RI

Project abstract

Type II diabetes (T2D) and metabolic syndrome (MS) are major diseases of the present times, that received epidemical proportion worldwide. Insulin resistance (IR) is associated with T2D and MS, and myocardial infarction and stroke represent their vascular complications. Diabetes associated morbidity (loss of vision, renal failure and amputation of lower extremities) implicate important socio-economic costs. Moreover, there is an alarming increase in the number of T2D children. The aim of this study is to investigate the mechanisms by which dyslipidemia induces IR. The leading principle of the whole strategy is to identify: key factors in lipid accumulation, in insulin signalling and in insulin sensibility; the relationship between insulin action and postprandial hyperlipemia; the cause of liver steatosis and the progress of inflammatory reactions; new drugs and nutraceutical products for the ceasing of dyslipidemia induced IR. In order to achieve these aims we propose the following methods and experimental models: 1) biochemical determinations for subject.s characterisation (adults and children) with IR; 2) culture cells for the evaluation of the mechanisms by which glycated lipoproteins induce IR, and also their role in the inflammatory processes; 3) molecular biology to study the signalling pathways involved in the regulation of the cellular receptors 4) flow-cytometry for oxidative stress determination; 5) an IR animal model induced by hyperlipemic diet; 6) to test the effect of some drugs (fibrates, tocopherol) and of some nutraceutical compounds on animal model and the cells involved in IR. The results will be correlated between them and also with the clinical data provided by partners and will contribute to: (a) the progress of the fundamental research regarding IR mechanisms, (b) the identification of new molecular markers, especially lipidic ones, which will help to detect earlier the subjects with IR risk, (d) the detection of new molecular targets with therapeutic potential. As a whole, the project propose the elaboration of new investigation and intervention methods based on molecular and cellular medicine, genomics and proteomics in the prevention of lipid metabolic disturbance which generate IR.

Durata proiectului

36 luni

Data inceperii

18/09/2007

Data finalizarii

18/09/2010

Valoarea totala a proiectului

2.000.000 RON

Valoarea finantarii de la bugetul de stat

2.000.000 RON

Directorul de proiect

Dr. Sima Anca Volumnia

Adresa e-mail a directorului de proiect

anca.sima@icbp.ro

Institutia coordonatoare

Institutul de Biologie si Patologie Celulara Nicolae Simionescu

Parteneri (denumire institutie)

1.Institutul de Diabet, Nutritie si Boli Metabolice "N.C. Paulescu"
2.Universitatea de Medicina si Farmacie "Carol Davila"
3.Compania de Cercetari Aplicative si Investitii - Departamentul de Cercetari Alimentare (fost Institutul de Chimie Alimentara)

Rezultate preliminare 2007

Obiectivul fazei 1 (unica, decembrie 2007):
Caracterizarea clinica, metabolica si a parametrilor biochimici la pacienti cu rezistenta la insulina.
Activitati specifice:
I.1. Constituirea loturilor de pacienti cu rezistenta la insulina (RI) adulti; determinarea parametrilor biochimici.
I.2. Adaptarea metodelor de lucru pe loturi de pacienti copii.
I.3. Realizarea profilului lipidic, activitatea enzimelor in ser la pacienti cu dislipidemie si RI.
I.4. Izolarea si caracterizarea HDL de la pacienti cu RI; activitatea antioxidanta paraoxonazica.
I.5. Intalnirea partenerilor in proiect - discutarea rezultatelor.
In cadrul fazei din anul 2007 a proiectului, fiecare partener a indeplinit activitatile ce ii reveneau conform planului de realizare al proiectului. Astfel, partenerul INDBM a realizat constituirea loturilor de subiecti normali si pacienti cu RI, caracterizarea clinica si metabolica a acestora, conducatorul de proiect (IBPC) a realizat caracterizarea parametrilor lipidici ai serurilor izolate de la subiecti adulti control si de la pacienti, iar partenerul UMFCD a pus la punct metodele prin care se vor caracteriza copiii cu RI.
Rezultatele fazei 1 au fost urmatoarele:
- constituirea loturilor de subiecti control si pacienti;
- caracterizarea lipidelor plasmatice: s-au demonstrat diferente statistic semnificative intre valorile unor parametri lipidici de la subiecti control si pacienti cu rezistenta la insulina; astfel, la trigliceride exista o crestere semnificativa statistic la subiectii obezi si pacienti cu RI, comparativ cu subiectii normoponderali, iar la HDL o scadere semnificativa statistic la pacientii cu RI, comparativ cu subiectii normo- si supra-ponderali;
- cresterea indicilor HOMA-IR, HOMA-S si a insulinei la pacientii cu RI, comparativ cu subiectii din grupul control;
- caracterizarea lipoproteinelor plasmatice pe baza realizarii profilelor cromatografice (FPLC) si lipidice ale serurilor pacientilor; s-a observat prezenta unor particule de LDL de dimensiuni mai mici si, presupunem, mai dense, cunoscute pentru aterogenicitatea lor, picurile corespunzatoare LDL din profilul FPLC de colesterol fiind deplasate spre dreapta;
- caracterizarea enzimelor plasmatice implicate in metabolismul lipidic: activitatea CETP si PLTP determinata in serul provenit de la pacienti s-a corelat pozitiv cu valorile trigliceridelor, colesterolului si glucozei, indicand o crestere de tip aterogen a activitatii acestor enzime;
- determinarea potentialului antioxidant seric a evidentiat o scadere statistic semnificativa a valorilor TRAP la subiectii obezi, precum si la pacientii cu RI, care au valori ale potentialului antioxidant semnificativ mai mici decat grupul cel mai defavorizat de subiecti normali, si anume cei cu obezitate.

Rezultate preliminare 2008

Obiectivul fazei 2 (unica, iunie 2008):
Identificarea efectelor dislipidemiei in RI; evaluare Lp transportoare de colesterol; cai de semnalizare.
Activitati specifice:
II.1. Obtinerea LDL-AGE de la subiecti cu RI sau preparat in vitro; caracterizarea lipidelor acumulate prin incubarea LDL-AGE cu CE si CMN; masurarea anizotropiei membranei celulare;
II.2. Obtinerea de culturi primare de celule endoteliale umane din vena ombilicala;
II.3. Evaluarea capacitatii receptorilor pentru Lp, CD36, LOX-1, SR .BI, LRP si RAGE de a internaliza LDL-AGE in CE si CMN; efectul insulinei;
II.4. Analiza expresiei receptorului pentru insulina (IR, IRS-1) in CE si CMN; molecule de semnalizare intracelulara Erk, Akt, p38;
II.5. Cuantificarea stresului oxidativ; masurarea ARNm al subunitatilor NADPH oxidazelor (NOX1, NOX4, p22phox, p47phox si p67phox) induse de LDL-AGE CE si CMN; masurarea activitatii NADPH oxidazei;
II.6. Determinarea expresiei genice si activitatii unor enzime lizozomale in CE si CMN incubate cu LDL-AGE;
II.7. Dezvoltare tehnologica: achizitie de echipament.
In cadrul acestei faze a proiectului, fiecare partener a indeplinit activitatile ce ii reveneau conform planului de realizare al proiectului. Astfel, conducatorul de proiect (IBPC) a realizat obtinerea de lipoproteine (Lp) glicate (LDL-AGE), obtinerea de culturi primare de celule endoteliale (CE) umane din vena ombilicala (HUVEC), a evaluat capacitatea receptorilor pentru Lp (CD36, LOX-1, SR.BI, LRP) de a internaliza LDL-AGE in CE si celule musculare netede (CMN) si efectul pe care il are insulina asupra acestui proces, a analizat expresia receptorului pentru insulina in CE si CMN si a unor molecule de semnalizare intracelulara, a cuantificat stresului oxidativ si expresia genica a subunitatilor NADPH oxidazelor (NOX1, NOX4, p22phox, p47phox si p67phox) induse de LDL-AGE CE si CMN si a determinat expresia genica si activitatea unor enzime lizozomale in CE si CMN incubate cu LDL-AGE. Partenerul INDBM a realizat recoltarea materialului biologic necesar obtinerii de lipoproteine native si glicate de la subiecti normali si pacienti cu RI, precum si caracterizarea clinica si metabolica a acestora. Partenerul UMFCD a efectuat masuratorile de anizotropie membranara pentru CE si CMN incubate cu LDL native sau LDL-AGE, iar partenerul ICA a realizat caracterizarea lipidelor acumulate intracelular prin incubarea CE cu LDL-AGE.
Rezultatele fazei 2 au fost urmatoarele:
1. Incubarea CE si CMN cu LDL glicate/normale a avut urmatoarele efecte:
- reducerea anizotropiei membranare, ceea ce sugereaza o crestere a fluiditatii in segmentul exterior al membranelor celulare;
- o compozitie diferita in acizi grasi a lipidelor acumulate intracelular induse de LDL glicate versus normale si diferita intre tipurile de celule (CE sau CMN).
2. Am stabilit un protocol accesibil si rapid de izolare si cultivare a HUVEC. Cultura primara confluenta de HUVEC poate fi obtinuta in 7-8 zile de la izolarea din cordonul ombilical si poat fi folosita si in subcultura, pentru maxim 3-4 pasaje.
3. LDL-AGE este implicat in generarea disfunctiei CE, astfel:
- a scazut expresia SR-BI care determina implicit scaderea cantitatii de oxid nitric - molecula cu prorietati ateroprotectoare, secretata de catre celula endoteliala;
- induce cresterea expresia receptorului LOX-1 implicat in preluarea lipidelor in celule;
- creste expresia receptorului LRP.
S-au observat urmatoarele efecte ale LDL-AGE in celule musculare netede:
- cresterea semnificativa a expresiei genice si proteice a receptorilor scavenger de clasa B (CD36 si SR-BI), precum si a LRP.
4. Am demonstrat ca unele dintre efectele biologice ale LDL-AGE asupra celulelor endoteliale si hepatocitelor se datoreaza activarii caii de semnalizare a PI3 kinazei.
5. LDL-AGE induce o crestere semnificativa a productiei intracelulare de ROS, a activitatii NADPH oxidazelor si a expresiei genice a subunitatilor NOX1 si p22phox.
6. LDL-AGE induce crestera activitatii lipazei acide lizozomale (LAL) in CE si CMN, iar in CE cantitatea de proteina LAL este semnificativ crescuta. Aceasta sugereaza ca LDL-AGE determina cresterea cantitatii de proteina LAL, fie prin inducerea expresiei genei LIPA fie prin accelerarea recrutarii enzimei din spatiul extracelular.