Cod proiect: PN-III-P1-1.1-PD2019-1234

Contract cu Nr. PD160/2020

Titlu proiect: Rolul interacțiunii dintre celulele stromale mezenchimale și fibroblaști în modularea fibrozei cardiace prin intermediul metaloproteinazei matriceale CD147

Acronim: FIBROSTEM

Director proiect: Popa Mirel Adrian

Perioadă finanțare: 24 luni

Suma: 246.950 lei

Scopul acestui proiect este de a reduce fibroza cardiacă printr-un mecanism celular dependent de calea de semnalizare FGFR2-CD147; datele obținute ar ajuta la o mai bună înțelegere a proceselor fiziologice ale fibrozei cardiace în care fibroblastul joacă un rol major. Ipoteza de la care s-a pornit este aceea că prin utilizarea celulelor stromale mezenchimale (MSC) ca vectori ai procesului de reducere a fibrozei, capacitatea fibroblaștilor activați (miofibroblaști) să fie modulată de prezența MSC prin schimbarea balanței dintre matrix metaloproteinaze (MMP) și inhibitori de MMP din țesut (TIMP). Acest proces, presupunem că, este controlat direct către prezența și concentrația CD147 (EMMPRIN sau Basigin) și receptorul de tip 2  pentru factorul de creștere al fibroblaștilor (FGFR2). Prin explorarea acestei noi căi de semnalizare se pot atenua efectele patologice ale fibrozei cardiace.

Obiectivele proiectului sunt:

Project code: PN-III-P1-1.1-PD2019-1234

Contract with No. PD160 / 2020

Project title: The role of the interaction between mesenchymal stromal cells and fibroblasts in the modulation of cardiac fibrosis by matrix metalloproteinase CD147

Acronym: FIBROSTEM

Project director: Popa Mirel Adrian

Financing period: 24 months

Amount: 246,950 lei

The aim of this project is to reduce cardiac fibrosis through a cellular mechanism dependent on the FGFR2-CD147 signaling pathway; The data obtained would help to better understand the physiological processes of cardiac fibrosis in which the fibroblast plays a major role. The hypothesis is that by using mesenchymal stromal cells (MSCs) as vectors of the fibrosis reduction process, the ability of activated fibroblasts (myofibroblasts) to be modulated by the presence of MSCs by changing the balance between matrix metalloproteinases (MMPs) and inhibitors of Tissue MMP (TIME). This process, we assume, is controlled directly to the presence and concentration of CD147 (EMMPRIN or Basigin) and the type 2 receptor for fibroblast growth factor (FGFR2). Exploring this new signaling pathway can alleviate the pathological effects of cardiac fibrosis.

The objectives of the project are:

1. Evaluation of the effect of CD147 on the activity of MSCs, myofibroblasts and human cardiomyocytes by analyzing their gene, protein and functional expression in two-dimensional and three-dimensional experimental models.
2. Investigation of the ability of MSCs or their paracrine products to modulate the functions and morphology of murine fibrous heart tissue using the FGFR2-CD147 pathway.

Rezultate

ETAPA 1-2020

Pentru prima parte a acestui proiect ce cuprinde perioada Septembrie 2020 - Decembrie 2020

Activități experimentale preliminare conform Obiectivului 1:

I. Am examinat efectul exercitat de către prezența proteinei recombinante CD147 (rhCD147) la diferite concentrații și intervale de timp asupra citotoxicității asupra MSC și modificării capacității de migrare celulară . Analiză făcută prin folosirea sistemul xCelligence (E-Plate și respectiv CIM-Plate)

II. Am analizat expresia genică a MSC-urilor stimulate la diferite concentrații de rhCD147, având ca focus principal genele implicate in modelarea țesutului fibrozat, precum MMP-2, MMP-9, MMP-14, TIMP-1, TIMP-2. Toate aceste experimente au fost validate prin tehnica de qRT-PC

Pentru determinarea efectului CD147/(BSG sau EMMPRIN) asupra celulelor stromale mezenchimale am utilizat o linie celulară primară umană caracterizată anterior. Această linie celulară a fost obținută din țesutul conjunctiv al cordonului ombilical, și anume, gelatina Wharton. În toate experimentele s-au utilizat linii celulare ce nu au fost cultivate mai mult de opt pasaje. La testarea efectului CD147 asupra MSC s-a folosit proteina recombinantă CD147(Rh-CD147) la concentrații de 1, 5 și 10 μg/mL la timpi diferiți (24, 48 și 72 de ore). Folosind aparatul xCelligence împreună cu plăcile speciale dedicate ePlate și CIM-Plate am putut determina efectul citotoxic al prezenței RhCD147 asupra MSC în timp real. Totodată am studiat și influența acesteia asupra capacității de migrare a MSC. 

• Prezența în mediul de cultură al celulelor a RhCD147 la concentrații de 1 și respectiv 5 μg/mL este benefică proliferării celulare și crește capacitatea celulelor de migrare;
• Stimularea MSC cu RhCD147 influențează balanța genelor implicate în migrarea și modelarea matricei extracelulare.
• Datorită acestor răspunsuri celulare, se conturează că prezența CD147 este benefică regenerării tisulare.

RESULTS

STAGE 1-2020

For the first part of this project which includes the period September 2020 - December 2020

Preliminary experimental activities according to Objective 1:

I. We examined the effect of the presence of recombinant protein CD147 (rhCD147) at different concentrations and time intervals on cytotoxicity on MSCs and altered cell migration capacity. Analysis using the xCelligence system (E-Plate and CIM-Plate respectively)

II. We analyzed the gene expression of MSCs stimulated at different concentrations of rhCD147, having as main focus the genes involved in the modeling of fibrous tissue, such as MMP-2, MMP-9, MMP-14, TIMP-1, TIMP-2. All these experiments were validated by the qRT-PC technique

To determine the effect of CD147 / (BSG or EMMPRIN) on mesenchymal stromal cells, we used a previously characterized human primary cell line. This cell line was obtained from the connective tissue of the umbilical cord, namely Wharton's gelatin. In all experiments, cell lines were used that did not cultivate more than eight passages. CD147 recombinant protein (Rh-CD147) was used to test the effect of CD147 on MSC at concentrations of 1, 5 and 10 μg / mL at different times (24, 48 and 72 hours). Using the xCelligence device together with the special dedicated ePlate and CIM-Plate boards we were able to determine the cytotoxic effect of the presence of RhCD147 on MSC in real time. We also studied its influence on the migration capacity of MSCs.

• The presence in the culture medium of RhCD147 cells at concentrations of 1 and 5 μg / mL, respectively, is beneficial for cell proliferation and increases the ability of cells to migrate;
• MSC stimulation with RhCD147 influences the balance of genes involved in extracellular matrix migration and modeling.
• Due to these cellular responses, the presence of CD147 is beneficial in tissue regeneration.

ETAPA 2-2021

 - Identificarea influenței receptorului de tip 2 pentru FGF (FGFR2) asupra activități balanței MMP/TIMP în fibroblaști cardiaci umani într-un mediu normal sau inflamator

Activitatea 2.1 - Testarea viabilității fibroblaștilor cardiaci în urma stimulării cu TGFβ și a transformării lor în miofibroblaști;

Activitatea 2.2 – Evaluarea expresiei moleculare a MMP și TIMP în miofibroblaștii stimulați cu inhibitor anti-FGFR2.

Activitatea 2.3 – Evaluarea activității proteolitice a MMP 2 și MMP9 și a concentrației  MMP14 în mediul de cultură al miofibroblaști stimulați cu inhibitor anti FGFR2.

Prin efectuarea activităților de mai sus am obținut următoarele rezultate preliminarii:

Rezultatele obținute în urma Activității 2.1:

- În urma acestei activități am stabilit faptul că stimularea fibroblaștilor cardiaci umani cu diferite de substanțe de interes pentru viitoarele experimente sunt viabili 72h în urma stimulării cu 26nM LY2874455 și 1 μM-Rh-BSG;

- În urma stimulării cu LY2874455 timp de o oră a CF, detecția receptorului de tip 2 pentru FGF a scăzută cu aproximativ 90%;

- Prin stimularea cu 5nM TGF β1 a CF timp de 24 de ore se observă o creștere a proteinei actină de tip α specifică mușchiului neted (αSMA) cu până la 50 %. Această proteină fiind un marker de caracterizare pentru fibroblaști activați sau miofibroblaști.

Rezultatele obținute în urma Activității 2.2:

- În urma stimulării MyCF cu Ly și Rh-BSG conform designului mai sus menționat, expresia genică a MMP2, MMP14, TIMP1 și TIMP2 a fost semnificativ modificată. De asemenea, prin prezența inhibitorului de FGFR2 s-a demonstrat și că raportul dintre TIMP și MMP2, MMP9 și MMP14 s-a modificat. Aceasta fiind o dovadă a rolului FGFR2 în modularea expresie genice în cazul MyCF.

Rezultatele obținute în urma Activității 2.3:

- Conform designului mai sus menționat, stimularea MyCF cu Ly și Rh-BSG a modificat si activitatea proteolitică a MMP și TIMP secretate în mediu și concentrația de MMP14 din același mediu condiționat.

STAGE 2-2021

- Identification of the influence of FGF type 2 receptor (FGFR2) on MMP / TIMP balance activity in human cardiac fibroblasts in a normal or inflammatory environment

Activity 2.1 - Testing the viability of cardiac fibroblasts following stimulation with TGFβ and their transformation into myofibroblasts;

Activity 2.2 - Evaluation of the molecular expression of MMP and TIMP in myofibroblasts stimulated with anti-FGFR2 inhibitor.

Activity 2.3 - Evaluation of the proteolytic activity of MMP 2 and MMP9 and the concentration of MMP14 in the culture medium of myofibroblasts stimulated with anti-FGFR2 inhibitor.

By performing the above activities we obtained the following preliminary results:

Results obtained from Activity 2.1:

- Following this activity we established that the stimulation of human cardiac fibroblasts with different substances of interest for future experiments are viable 72h after stimulation with 26nM LY2874455 and 1 μM-Rh-BSG;

- After one hour of CF stimulation with LY2874455, FGF type 2 receptor detection decreased by approximately 90%;

- By stimulating CF with 5nM TGF β1 for 24 hours, an increase in smooth muscle-specific α-actin protein (αSMA) of up to 50% is observed. This protein is a characterization marker for activated fibroblasts or myofibroblasts.

Results obtained from Activity 2.2:

- Following stimulation of MyCF with Ly and Rh-BSG according to the above-mentioned design, the gene expression of MMP2, MMP14, TIMP1 and TIMP2 was significantly altered. The presence of the FGFR2 inhibitor has also been shown to change the ratio of TIMP to MMP2, MMP9 and MMP14. This is evidence of the role of FGFR2 in modulating gene expression in MyCF.

Results from Activity 2.3:

- According to the above-mentioned design, the stimulation of MyCF with Ly and Rh-BSG also modified the proteolytic activity of MMP and TIMP secreted in the environment and the concentration of MMP14 in the same conditioned environment.

Etapa 3. - Evaluarea MSC-urilor și efectele factorilor secretați (CD147) asupra funcțiilor cardiace, morfologiei și echilibrului MMP-urilor într-un model in vivo

Activitatea 3.1 - Cuantificarea nivelului seric al MMP-urilor de șoarece și al anti-MMP-urilor după administrarea de factori secretați de MSCs sau MSC-uri umane la șoareci cu ischemie cardiacă indusă;

Activitatea 3.2 - Măsurarea funcțiilor și structurii cardiace după administrarea MSC-urilor și/sau a factorilor secretați de către MSC la șoarecii imunosupresați cu fibroză cardiacă indusă;

Step 3. - Evaluation of MSCs and the effects of secreted factors (CD147) on cardiac functions, morphology and MMP balance in an in vivo model

Activity 3.1 - Quantification of the serum level of mouse MMPs and anti-MMPs after the administration of factors secreted by MSCs or human MSCs in mice with induced cardiac ischemia;

Activity 3.2 - Measurement of cardiac functions and structure after administration of MSCs and/or factors secreted by MSCs to immunosuppressed mice with induced cardiac fibrosis;

Raport final       

Diseminarea rezultatelor s-a efectuat prin următoarele:

-          două articole:

ü  https://doi.org/10.3390/cells100  -„Proteomic Analysis of Estrogen-Mediated Enhancement of Mesenchymal Stem Cell-Induced Angiogenesis In Vivo”

ü  doi:10.1002/2211-5463.13442  - „Fibroblast growth factor receptor-2 modulates the MMP2 and MMP14/TIMP1 ratio in human cardiac myofibroblasts„

-          titlul celor două prezentări orale la conferințe:

• Simpozionul din 4-6 NOVEMBER - THE 42nd ANNIVERSARY SYMPOSIUM OF THE INSTITUTE OF CELLULAR BIOLOGY AND PATHOLOGY “NICOLAE SIMIONESCU” held jointly with THE 38th ANNUAL SCIENTIFIC SESSION OF THE ROMANIAN SOCIETY FOR CELL BIOLOGY. Titlul prezentării a fost: THE ROLE OF FGFR2 SIGNALING IN MODULATING MMP/TIMP BALANCE IN CARDIAC MYOFIBROBLASTS

• The Biochemistry Global Summit, 25th IUBMB Congress, 46th FEBS Congress, 15th PABMB Congress, July 9–14, 2022, Lisbon, Portugal cu titlul: „Fibroblast growth factor receptor-2 modulates the MMP2 and MMP14/TIMP1 ratio in human cardiac myofibroblasts„

-          articol în curs de publicare:

• Cu titlul: „Mechanism of dihydrotestosterone stimulated endothelial progenitors cells in heart tissue„. Urmând a fi publicat  în revista Cells

 The dissemination of the results was carried out through the following:

- two articles:

- https://doi.org/10.3390/cells100 - "Proteomic Analysis of Estrogen-Mediated Enhancement of Mesenchymal Stem Cell-Induced Angiogenesis In Vivo"

- doi:10.1002/2211-5463.13442 - "Fibroblast growth factor receptor-2 modulates the MMP2 and MMP14/TIMP1 ratio in human cardiac myofibroblasts"

- the title of the two oral presentations at conferences:

-The symposium from 4-6 NOVEMBER - THE 42nd ANNIVERSARY SYMPOSIUM OF THE INSTITUTE OF CELLULAR BIOLOGY AND PATHOLOGY "NICOLAE SIMIONESCU" held jointly with THE 38th ANNUAL SCIENTIFIC SESSION OF THE ROMANIAN SOCIETY FOR CELL BIOLOGY. The title of the presentation was: THE ROLE OF FGFR2 SIGNALING IN MODULATING MMP/TIM BALANCE IN CARDIAC MYOFIBROBLASTS

-The Biochemistry Global Summit, 25th IUBMB Congress, 46th FEBS Congress, 15th PABMB Congress, July 9–14, 2022, Lisbon, Portugal with the title: "Fibroblast growth factor receptor-2 modulates the MMP2 and MMP14/TIMP1 ratio in human cardiac myofibroblasts"

- article in progress:

-With the title: "Mechanism of dihydrotestosterone stimulated endothelial progenitors cells in heart tissue". To be published in the journal Cells