National Grants
Development of new strategies to improve cell survival and differentiation of stem cells after transplantation into the ischemic myocardium. CNCSIS PNII-TE 105/2010, Coordinator: Alexandrina Burlacu, Ph.D.
Many clinical trials showed that there were no long term relevant differences between infarcted myocardium with and without cellular transplant, despite numerous studies showing the transient efficiency of stem cell (SC) therapy on reducing the infarct size and improvement of cardiac function. The explanation was given by demonstrating that the transplanted cells were poorly retained into the heart and the large majority died post-transplantation. Thus, it is likely that the cardiac improvement is not due to the myocardial regeneration but rather to the biomolecules secreted by SC, which can improve the remodeling for short time. This conclusion has prompted a re-consideration of SC field and imposed the stringency of developing new strategies that can maximize cell survival, engraftment and differentiation. Our project aims to develop an effective cellular transplantation strategy based on the understanding of the microenvironment in which cells are to engraft and differentiate and the response of SC to the environmental inflammatory factors. The following SC sources will be used in our studies: embryonic stem cells, mesechymal stem cells and endothelial progenitor cells. The objectives of this project are: (i) to study the dynamic of the modifications occurring in the ischemic myocardium; (ii) to analyze the response of SC to the inflammatory factors; (iii) to study the SC paracrine effects on myocardial cells; (iv) in vitro pre-differentiation of SC into cardiac cells; (v) to validate the set conditions for transplantation by in vivo assessing of survival and engraftment of injected cells. Thus, the first four objectives have been appointed to suggest a differentiation strategy, whose applicability is to be validated on the in vivo mouse model of cardiac ischemia-reperfusion at the end of this project. The importance and originality of this project reside in addressing a still unsolved issue, namely that of understanding the mechanisms involved in SC grafting.
Multe trialuri arata ca nu exista diferente pe termen lung intre functia unui miocard infarctizat cu transplant si fara, desi pe termen scurt, unele studii au aratat eficienta transplantului cu celule stem (CS) in reducerea marimii infarctului si imbunatatirea functiei cardiace. Explicatia a fost gasita in faptul ca celulele transplantate sunt slab retinute in inima infarctizata si ca majoritatea lor mor dupa transplantare. Astfel, se pare ca imbunatatirea cardiaca nu este datorata regenerarii miocardului, ci biomoleculelor secretate de CS care pot imbunatati pentru o perioada de timp remodelarea. Aceste concluzii au dus la reconsiderarea observatiilor anterioare in domeniul CS si au impus necesitatea dezvoltarii de noi strategii bazate pe supravietuirea, grefarea si diferentierea celulara dupa transplantare. Prin acest proiect tintim elaborarea unei strategii eficiente de transplant celular bazate pe cunoasterea mediului in care celulele se grefeaza si urmeaza sa se diferentieze si pe raspunsul CS la actiunea factorilor din micromediu. Ca surse de CS vom utiliza celule stem embrionare, celule stem mezenchimale adulte si celule endoteliale progenitoare. Obiectivele propuse in acest proiect sunt: (i) studiul dinamicii modificarilor aparute in miocardul ischemic; (ii) analiza raspunsului CS la actiunea factorilor inflamatori; (iii) studiul efectelor paracrine ale CS asupra celulelor din miocard; (iv) pre-diferentierea in vitro a CS in celule cardiace; (v) validarea unor conditii de transplant prin testarea in vivo a grefarii si supravietuirii celulelor transplantate. Astfel, primele obiective ale proiectului sunt menite sa sugereze o strategie de transplant, a carei eficienta va fi validata in finalul proiectului pe modelul de soarece cu ischemie-reperfuzie miocardica in vivo. Importanta si originalitatea acestui proiect rezida in abordarea unei laturi insuficient studiata, anume aceea a intelegerii mecanismelor implicate in grefarea intratisulara a CS.
Raportul primei etape (sinteza)(perioada 3.08.2010-1.12.2010)
Scopul acestui proiect il reprezinta cunoasterea micromediului in care celulele stem (CS) se grefeaza si urmeaza sa se diferentieze (miocardul modificat de ischemie) si a raspunsului CS la actiunea factorilor inflamatori din micromediu. Pentru aceasta, primul obiectiv pe care ni l-am propus este studiul evolutiei in timp a modificarilor aparute in miocardul ischemic.
In ciuda multitudinii de date care semnaleaza prezenta crescuta a diferitor citokine, molecule de semnalizare, markeri de moarte si molecule angiogene odata cu instalarea ischemiei in diverse modele experimentale, nu exista pana in prezent o imagine globala a acestor modificari. De aceea, ne-am propus cuantificarea unor biomolecule in probe de miocard afectat de ischemie cu si fara reperfuzie. Modelul experimental de soarece cu ischemie-reperfuzie miocardica a fost standardizat de membrii grupului nostru in cadrul unui proiect anterior. Pe scurt, soarecii anesteziati cu ketamina-xilazina-acepromazina (80-5-1 mg/kg corp) au fost ventilati artificial si mentinuti pe o placa de incalzire la 37°C. Ligatura arterei coronare stangi s-a facut dupa desfacerea muschilor intercostali (la nivelul spatiului intercostal 4) si indepartarea pericardului. Pentru ligatura s-au folosit fire de sutura de polipropilena cu dimensiuni 7-0. Reprezentarea principalelor etape ale interventiei chirurgicale de ligaturare a arterei coronare stangi este schematizata in figura 1. Modificarile induse de ligatura au fost permanent monitorizate pe ECG. Conform unui studiu publicat anterior de grupul nostru, ligatura arterei coronare stangi este urmata de modificari ale ECG (cresterea inaltimii ST si prelungirea segmentului QTc), care valideaza ligatura corecta a vasului si elimina variabilitatea asociata cu paloarea cardiaca indusa de ligatura.
Figura 1. Reprezentarea schematica a principalelor etape din interventia microchirurgicala de ligaturare a arteri coronare stangi la soarece, in scopul inducerii infarctului miocardice. (a) Soarecele anesteziat este pozitionat pe masa de operatie; traheea este expusa pentru intubare orotraheala. In inset este ilustrata traheea, in interiorul careia se observa prin transparenta acul de intubatie. (b) Avand cavitatea toracica expusa (prin indepartarea pielii si a straturilor musculare), incizia toracala este realizata la nivelul spatiului intercostal 4 pentru a expune inima. Artera coronara este evidentiata pe inima astfel expusa prin presarea usoara a fetei anterioare a ventricolului stang, chiar sub varful auriculului. (c) Dupa ligaturarea arterei coronare, cavitatea toracica, muschii si pielea sunt suturate individual.
Animalele a caror inregistrare ECG dupa ligatura nu au aratat modificarile mai sus mentionate au fost inlaturate din analiza, ca si acelea la care reperfuzia nu s-a realizat corespunzator. Reperfuzia a fost confirmata tot prin analiza ECG, cunoscut fiind din studiile anterioare ca aceasta este urmata de revenirea partiala a modificarilor ECG (in special inaltimea ST). Modificarile ECG inainte si dupa reperfuzia care a urmat dupa o ora de ischemie sunt redate in figura 2.
Pentru analiza modificarilor cardiace in timpul ischemiei si in ischemie-reperfuzie, lotul de soareci a fost impartit in 3 grupe: (i) grupul control. Care a suferit interventie chirurgicala insa fara strangerea nodului de ligatura; (ii) grupul cu ischemie-reperfuzie, la care ligatura a fost eliberata dupa o ora de ischemie, reperfuzia fiind realizata diferite intervale de timp (1 ora, 1 zi, sau 7 zile); (iii) grupul cu ischemie permanenta, la care ligatura a fost mentinuta pana la sacrificarea soarecilor pentru analiza (1 ora, 1 zi, sau 7 zile).
Figura 2. Electrocardiogramele continand inregistrari inainte de ischemie (before ligation), dupa 1 ora de ischemie (during ligation) si dupa reperfuzia asociata cu 1 ora de ischemie (after reperfusion). Se observaca o ora de ischemie induce modificari severe (cresterea inaltimii ST si prelungirea segmentului QTc), care nu au fost abrogate complet de reperfuzie.
Studiul in paralel pe cele doua modele de ischemie miocardica in vivo (ischemie cronica si ischemie-reperfuzie) a avut ca scop delimitarea efectelor induse de ischemie de cele produse in reperfuzie. In paralel cu modificarile induse de ischemie in miocard in vivo au fost urmarite si modificarile induse in vitro pe sectiuni de miocard. Astfel, au fost analizate sectiuni de miocard adult, neonatal si fetal, dupa incubare in cultura in conditii de ischemie pentru o ora, urmata de incubarea in mediu de cultura normal (reperfuzia) pentru diferite intervale de timp (1 ora, 1 zi, 7 zile).
Sectiunile de miocard fetal si neonatal au fost obtinute de la fetusi de 13.5 dpc, respectiv de la soareci de o zi. Cele trei sectiuni de miocard obtinute de la o inima fetala sau neonatala (dupa prodeceul sumarizat in figura 3) au fost introduse intr-un godeu de placa cu 96 godeuri si, dupa pre-echilibrare in tampon normal pentru 30 minute, au fost incubate o ora in tampon ischemic si in prezenta de 1% O2, dupa care au fost fie analizate, fie incubate in continuare in mediu de cultura normal (DMEM suplimentat cu 10% ser) pentru diferite intervale de timp (1, 2, 7 zile) pentru mimarea reperfuziei. Compozitia tamponului normal folosit pentru pre-echilibrare si pentru incubarea in conditii normale (control) a fost in mM: NaCl 118, KCl 4.8, NaHCO3 27.2, KH2PO4 1, MgCl2 1.2, CaCl2 1.25, glucoza 10, Hepes 20. Tamponul ischemic a avut o compozitie identica cu cel normal, cu exceptia faptului ca continea 9.6 mM KCl (in loc de 4.8) si 10 mM deoxi-glucoza (in loc de glucoza).
Sectiunile de miocard adult au fost obtinute prin sectionarea la vibratom a inimilor adulte imediat dupa recoltare. Din fiecare inima adulta au fost asftel obtinute 21 sectiuni (cu grosime de 300mm) care au fost incubate in placi de 24 godeuri (cate 3 sectiuni/godeu) in mediu de cultura normal. Procedura de taiere a unei inimi dureaza ~ 1 ora. Dupa ce au fost obtinute toate sectiunile, mediul de cultura a fost inlocuit cu tampon normal pentru pre-echilibrare pentru 30 minute, apoi cu tampon ischemic (1 ora), urmat de mediu de cultura suplimentat cu 10% ser fetal bovin pentru 1, 2 sau 7 zile. La finalul acesto intervale de timp, mediul conditionat a fost recuperat pentru dozari ELISA, iar inimile au fost prelucrate fie pentru obtinere de lizat total (pentru analize de Western blot), fie pentru izolare de RNA (pentru studii de RT-PCR).
Testele de viabilitate au aratat ca inimile fetale isi pastreaza viabilitatea timp de 7 zile in conditiile de cultura descrise mai sus. Ischemia induce o scadere a viabilitatii miocardului fetal aproximativ la jumatatea din valoarea miocardului normal. Insa, datorita capacitatii de proliferare a celulelor fetale, valorile viabilitatii ating valorile initiale dupa 2 zile de cultivare post-ischemie. In ceea ce priveste contractilitatea miocardului fetal in vitro, aceasta s-a pastrat timp de 7 zile in cultura la aproximativ jumatate din sectiunile initial contractile si nu a parut a fi influentata de conditia de ischemie. Mai mult, examinarea la microscopul de contrast de faza a aratat ca nu exista diferente aparente intre sectiunile care si-au pastrat contractilitatea dupa 7 zile si cele necontractile dupa acest interval de cultivare.
In ceea ce priveste raspunsul miocardului fetal la ischemie, rezultatele au aratat ca acesta este rezistent la apoptoza, cel putin din punct de vedere al balantei intre proteinele antiapoptotice (Bcl-2) si pro-apoptotice (Bax). Dozarile Elisa realizate din supernatantele inimilor fetale au evidentiat valori crescute de VEGF si SDF in ischemie, in concordanta cu datele din literatura. De asemenea, au fost obtinute valori minime ale secretiei de Il-6 si TNF in miocardul fetal (atat in conditii ischemice, cat si normale), precum si valori scazute ale TGF dupa 7 zile de reperfuzie post-ischemica, comparativ cu controlul.
In ceea ce priveste situatia inimilor neonatale si adulte, viabilitatea acestora a fost afectata prin cultivarea in vitro, sectiunile rezinstand doar 2 zile. Rezultatele au aratat valori scazute de TGFβ, VEGF si SDF in aceste probe, comparativ cu inimile fetale.
Analiza probelor de miocard adult in vivo a aratat prezenta unor nivele crescute de TGFβ dupa o ora de ischemie si nivele crescute de IL-6 dupa o ora de reperfuzie post-ischemica. De asemenea, dupa 7 zile de ischemie, respectiv 7 zile de reperfuzie post-ischemica, modificarile miocardice in vivo pot fi sumarizate astfel: valori crescute de HGF si receptorul sau specific c-Met (atat in ischemie-reperfuzie, dar mai mult in ischemie cronica); valori semnificativ crescute de TGFβ in ischemia cronica dupa 7 zile (demonstrand aparitia tesutului cicatrizant); valori scazute de CGL (carboxil-γ-liaza, implicata in sinteza H2S, cu rol protector in miocard) care capata valori semnificative in ischemia cronica (dupa 7 zile).
In ceea ce priveste caile de semnalizare implicate in ischemie, atat in miocardul adult in vivo, cat si in miocardul fetal in vitro, s-a constatat o reducere a activitatii ERK, enzima implicate in promovarea supravietuirii/apoptozei celulare. Nivelele de P-ERK sunt scazute dupa o ora de ischemie (in ambele modele studiate), insa redevin la nivele similare cu controlul dupa reperfuzie (in cazul miocardului fetal). Acest lucru demonstreaza rezistenta crescuta a miocardului fetal in conditii de ischemie/reperfuzie, comparativ cu miocardul adult.
In concluzie, rezultatele au aratat faptul ca ischemia afecteaza atat miocardul fetal, cat si cel adult. Acest lucru este ilustrat atat prin valorile scazute ale MTT in miocardul fetal dupa 1 ora de ischemie, cat si prin valorile scazute ale P-ERK in miocardul adult si cel fetal. Cu toate ca miocardul fetal raspunde la ischemie prin manifestarile generale ale tesuturilor la ischemie (cresterea valorilor de SDF si VEGF secretate in mediul de cultura), el este mult mai rezistent la reperfuzia post-ischemica, fapt demonstrat prin revenirea la valori similare cu controlul dupa 1 zi de reperfuzie si mentinerea nivelelor similare si la 2 si 7 zile post-reperfuzie. In plus, miocardul fetal nu raspunde la ischemie prin formare de cicatrice, dimpotriva valorile TGF scad in miocardul fetal in ischemie-reperfuzie. Spre deosebire de miocardul fetal, miocardul adult raspunde la ischemie cronica prin scaderea nivelelor de CGL si formare de tesut cicatrizant (ilustrat prin cresterea nivelelor de TGFβ, atat in supernatant, cat si la nivel de mRNA). Reperfuzia induce raspuns inflamator (cresterea de IL-6 dupa 1 ora de reperfuzie post-ischemica), ca si cresteri ale nivelelor de HGF si c-met, implicate in reparare.
Probabil diferenta in raspunsul miocardului fetal si cel adult la conditiile iaschemice este data de prezenta TGFβ. Izoforma de TGFβ prezent la adult este TGFβ1, in timp ce izoforma fetala este TGFβ3. TGFβ3 este cunoscut in literatura ca induce repararea miocardului fara formarea de scar. Experimente ulterioare vor duce la stabilirea dinamicii expresiei acestor molecule, care pot afecta grefarea celulelor stem si, astfel, vor duce la stabilirea momentului optim pentru interventia prin transplant celular.
Raportul etapei II (sinteza)(perioada 1.12.2010-10.12.2011)
In aceasta faza ne-am propus testarea potentialului paracrin al CSM si al CEP asupra celulelor din miocard, cu precadere asupra cardiomiocitelor (CMC) si al celulelor endoteliale (CE). Pentru a testa efectul hipoxiei asupra apoptozei CSM, a fost determinata activitatea Caspazei-3 si expresia unor proteine pro- si anti-apoptotice. Hipoxia a indus o crestere de 1.7 ori a activitatii enzimatice a Caspazei-3, insa nu a afectat semnificativ raportul proteinelor Bax/Bcl-2 la nivelul expresiei lor genice (figura 1). Acesti 2 membrii apartinand familiei Bcl-2 au functii opuse in reglarea apoptozei (Bax este pro-apoptotic, Bcl-2 este anti-apoptotic), iar raportul crescut Bax/Bcl-2 este deseori corelat cu apoptoza, prin cresterea permeabilitatii mitocondriale si eliberarea citoplasmatica a citocromului c.
Figura 1. Activitatea caspazei-3 (stanga) si raportul Bax/Bcl-2 mRNA in CSM dupa expunerea pentru 24 ore la conditii hipoxice.
Rezistenta CSM la hipoxie a fost de asemenea confirmata prin experimente in care s-a determinat potentialul membranar mitocondrial (ΔΨm), prin colorare cu JC-1. Expunerea celulelor la hipoxie pentru 24 ore nu a modificat ΔΨm, fapt demonstrat prin acumularea lui JC-1 exclusiv in mitocondrie sub forma de aggregate rosii (figura 2).
Figura 2. Prezervarea potentialului mitocondrial membranar (ΔΨm) in CSM dupa expunerea la conditii hipoxice.
Eficienta terapia celulara cu CSM este dependenta de abilitatea acestora de a se grefa in tesutul gazda si de a secreta activ factori protectori cu contributie la regenerarea tisulara. Experimentele noastre (figura 3) au aratat faptul ca VEGF a fost secretat la un nivel crescut de catre celulele expuse la hipoxie, comparativ cu celulele crescute in conditii normale. In schimb, expresia de TGFβ a fost similara in celulele hipoxice si normoxice (atat la nivel de mRNA, cat si la nivel proteic), ca de altfel si nivelul proteinei secretate in supernatant. De asemenea, dupa tratamentul hypoxic, CSM continua sa secrete nivele crescute de MMP-9.
Figura 3. a) Nivelul de VEGF determinat prin ELISA in supernatantul CSM dupa incubarea in conditii hipoxice si normale; b) Determinarea prin ELISpot a formelor active si pro-formelor de MMP-9 eliberate de CSM; c) Expresia (la nivel proteic si de expresie genica) si nivelul de secretie al TGFβ1 in CSM dupa expunerea la hipoxie.
Evaluarea expresiei genice a factorilor implicati in homingul si grefarea CSM a demonstrate cresteri semnificative atat pentru factori pro-angiogeni (SDF, CXCR4, HGF), cat si pentru factori implicati in grefare (integrin α1 and collagen3a) in CSM hipoxice comparative cu CSM normale (figura 4).
Figura 4. Real-time PCR pentru cuantificarea expresiei CXCR4, HGF, SDF, integrin α1 si a collagen 3a in CSM normale si hipoxice.
Efectul protector al CSM asupra miocitelor cardiace a fost urmarit in conditii de ischemie, pentru a mima infarctul de miocard. Hipoxia CMC a avut ca rezultat pierderea ΔΨm, demonstrata prin acumularea lui JC-1 ca monomeri fluorescenti verzi (figura 5).
Figura 5. Evaluarea pierderii de ΔΨm exprimata prin cresterea raportului dintre fluorescenta la 535 nm si 610 nm si efectul protector alnMSC_CM si hypMSC-CM asupra restabilirii ΔΨm. De-asupra graficului este ilustrata o imagine reprezentativa a celulelor colorate cu JC-1 dupa expunerea la hipoxie. Mitocondriile intacte sunt vizibile ca aggregate rosii. Prin depolarizare, fluorescenta rosie este inlocuita cu cea verde.
Fluorescenta lui JC-1 a fost determinata prin fluorimetrie si pierderea ΔΨm a fost confirmata prin cresterea raportului de fluorescenta 535 nm/ 610 nm. Prezenta in mediul de cultura al CMC a nMSC-CM si hypMSC-CM a avut drept rezultat atenuarea pierderii ΔΨm, comparativ cu controlul (CMC incubate in conditii hipoxice in absenta serului). Aceste rezultate sugereaza prezenta unor factori protectori pentru mitocondrie atat in mediul conditionat provenit de la CSM incubate in conditii normale (nMSC-CM), cat si in cel provenit de la CSM incubate in conditii hipoxice (hypMSC-CM).
Cuantificarea apoptozei celulare dupa incubarea CMC in conditii hipoxice a relevat un effect protector similar pentru nMSC-CM si hypMSC-CM (figura 6) asupra CMC. Aceste date releva existenta unor factori paracrini cu rol protector pentru miocard.
Figura 6. Determinarea apoptozei CMC dupa expunerea la hipoxie in prezenta si absenta de MSC-CM. Diagrama reprezinta procentul de nuclei apoptotici determinat prin colorarea DNA-ului cu Hoechst 33258. Imaginea de microscopie de fluorescenta de sus releva o reactie de colorare a nucleilor cu Hoechst, aratand celule in diviziune (sageata) si celule apoptotice (cap de sageata).
Pentru a valida aceste rezultate, raspunsul dinamic al celulelor expuse la hipoxie/reoxigenare a fost evaluat cu sistemul xCELLigence. Pentru aceste experimente, CMC au fost incubate pe placi speciale (E-plates, care contin microelectrozi de aur pe suprafata lor) pentru 2 zile, dupa care au fost deprivate de ser 24h (starvation) si expuse la hipoxie pentru alte 24h in prezenta de nMSC-CM sau hypMSC-CM (figura 7). In ambele situatii, o crestere a indexului celular a fost observata, demonstrand un efect paracrin benefic al mediului conditionat.
Figura 7. Raspunsul CMC la hipoxie in prezenta si absenta de MSC-CM. Celule incubate in mediu fara ser au fost definite ca baseline, iar datele au fost normalizate la momentul dinaintea starvarii celulelor. Graficul din dreapta ilustreaza valorile indexului celular normalizat la 24 ore de la re-oxigenare.
Pentru a testa proprietatile chemoatractante ale MSC-CM in vivo, matrigel impregnat cu mediu conditionat a fost injectat in soareci adulti. Drept controale, s-au folosit matrigel simplu si cu FGFb (control pozitiv si negativ). Examinarea histologica a matrigelului cu FGF a relevat o puternica invazie de celule la 7 zile de la injectare.
Figura 8. Potentialul vasculogenic al CSM. Matrigel simplu sau continand nMSC-CM, hypMSC-CM sau FGFb a fost evaluat la 7 zile dupa implantarea in soareci.
Spre deosebire de matrigelul fara factori, prezenta MSC-CM a determinat popularea matrigelului cu celule inflamatoare si formarea unor structuri asemanatoare capilarelor (figura 8). Aceste observatii sugereaza faptul ca MSC, atat in conditii normale cat si hipoxice, secreta factori care induc invazia celulelor endoteliale si formarea de neovase in vivo.
Pentru testarea potentialului CSM de a induce migrarea CE, s-a utilizat sistemul xCELLigence si placile CIM (camere duble similare placilor Boyden, dar care contin microelectrozi pe fata inferioara a filtrului pentru determinarea impedantei electrice). Determinarea indexului celular la 3 ore de la insamantarea CE pe placi CIM a demonstrat un puternic efect chemoattractant al MSC-CM (atat normal, cat si hypoxic) asupra CE (figura 9).
Figura 9. Migrarea chemotactica a CE ca raspuns la prezenta factorilor din nMSC-CM si hyp MSC-CM. Diagrama din dreapta ilistreaza indexul celular dupa 3 ore.
Acest efect migrator a fost de asemenea evaluat prin tehnica “scratch test”. Asa cum este ilustrat in figura 10, atat nMSC-CM, cat si hypMSC-CM au avut importante contributii paracrine asupra migrarii CE si au produs efecte similare cu cele ale serului (figura 10).
Figura 10. Scratch test pe cellule endoteliale. Celulele au fost zgariate, incubate in prezenta de nMSC-CM sau hyp MSC-CM si fotofrafiate la t=0 si t=8h de la zgariere. Suprafata ariei acoperite a fost cuantificata ca procent din aria initial zgariata.
Luate impreuna, aceste rezultate demonstreaza proprietati importante ale CSM asupra chemotaxiei si migrarii CE, atat in conditii normale, cat si hipoxice. Aceste efecte sunt importante pentru inducerea angiogenezei dupa transplantarea CSM in miocardul cu infarct. Oricum, pentru ca angiogeneza sa fie completa, migrarea CE trebuie sa fie insotita de grefarea si proliferarea lor la situsul de infarct. Pentru testarea potentialului CSM de a induce aderarea si proliferarea CE, CE au fost insamantate pe E-plates, fie direct in prezenta mediului conditionat (figura 11 stanga, pentru determinarea aderarii), fie mai intai incubate in prezenta de ser (pentru 3 ore) dupa care au fost incubate in prezenta de CM (figura 11 dreapta, pentru determinarea efectului asupra proliferarii). Rezultatele au aratat capacitatea mediului conditionat de a induce aderarea CE, insa incapacitatea lui de a induce proliferarea CE dupa aderare.
Comparativ cu CSM, efectul CEP a fost invers: acestea suporta proliferarea CE dupa aderare, insa nu contin factori de aderare pentru CE.
Figura 11. Efectul MC asupra aderarii (stanga) si proliferarii (dreapta) CE.
Aceste rezultate ne-au determinat sa testam efectul combinat al mediilor conditionate provenite de la CSM si CEP. Rezultatele au demonstrat capacitatea factorilor secretati de CSM si CEP de a suporta atat aderarea cat si proliferarea CE, sugerand o angiogeneza completa. Mai mult, efectul a fost chiar mai buna atunci cand MC a fost derivat de la cele 2 tipuri de celule stem/progenitoare in conditii hipoxice (figura 12).
Figura 12. (stanga) Efectul combinat al MSC-CM si EPC-CM asupra aderarii si prolifearrii CE. (dreapta) Efectul MC provenit de la cellule hipoxice si normale asupra aderarii si proliferarii CE.
Alte rezultate importante obtinute in aceasta faza: Tratamentul CSM cu factori de crestere (FGF-2, si IGF-1) a indus cresterea expresiei proteice a connexinei 43 (Cx43), ceea ce poate determina o grefare mai buna a celulelor stem in miocardul infarctizat. Stimularea celulelor cu factori de crestere diferiti a indus insa localizarea diferita a Cx43 la nivel celular, astfel FGF-2 a determinat o localizare citosolica a Cx43 in timp ce IGF-1 a determinat dispunerea ei membranara la nivelul jonctiunilor gap. Aceaste rezultate indica faptul ca pot aparea diferente semnificative in celulele stem la stimularea acestora cu diferiti factori de crestere astfel fiind necesara o atentie mai mare atunci cand se doreste stimularea celulelor stem inainte de a fi transplantate.
Totodata, in cadrul acestei faze a fost pregatit si caracterizat un lot de soareci cu ischemie femurala. Caracterizarea modelului este ilustrata in figura 13.
Figura 13. A) Viabilitatea muschiilor gastrocnemian si aductor determinate cu MTT dupa ligaturarea arterei femurale. Viabilitatea muschiului gastrocnemian este redusa la 50% din cea a membrului neafectat, in timo ce viabilitatea muschiului aductor nu a fost afectata; B) Colorare tricromana Masson a muschiului gastrocnemian pentru detectarea necrozei musculare, dupa 7 zile de ischemie. Zonele necrotice cu fibroza sunt evidentiate prin culoarea albastra in muschiul ischemic (b), comparative cu muschiul normal (c).
In concluzie, rezultatele obtinute demonstreaza ca: (i) CSM isi mentin proprietatile paracrine in conditii benefice; (ii) CSM secreta factori care suporta doar partial angiogeneza, prin stimularea chemotaxiei si adeziunii CE, insa fara a fi capabili sa induca proliferarea CE dupa aderare; (iii) CEP prezinta efecte complementare asupra angiogenezei: ele sunt capabile sa induce proliferarea, dar nu adeziunea CE; (iv) angiogeneza poate fi stimulata cu success prin combinarea mediului conditionat provenit de la CSM si CEP; acest efect paracrin este si mai puternic dupa expunerea celulelor stem/progenitoare la conditii hipoxice.
Raportul etapei 3 (Sinteza)(perioada 10.12.2011-1.12.2012)
In etapa actuala, am studiat potentialul CS embrionare (CSE) si adulte (CSA) de a se diferentia in CMC in vitro prin interactia lor cu TGFb, FGF sau celule musculare cardiace in co-cultura.
In ceea ce priveste comportamentul CSA sub actiunea TGFb si FGF, studiile au fost efectuate pe celule stem mezenchimale (CSM) izolate din maduva osoasa hematogena de la soarecele adult. Aceste celule au fost obtinute de grupul nostru si caracterizate, pentru confirmarea potentialului lor multipotent.
Prima modificare observata in CSM in prezenta de FGF este a fenotipului celular. Imediat dupa tratament, celulele devin acinoase, fapt demonstrat atat prin microscopia in contrast de faza, cat si prin studii in timp real, de masurare a impedantei utilizand modulul xCELLigence de la Roche. Acest lucru este in concordanta cu datele din literatura care sustin capacitatea FGF de a induce tranzitia epithelial-mesenchymal.
La nivel genic, Expunerea CSM in conditii de hipoxie determina scaderea expresiei FGFb. Cu toate acestea, nici unul din factorii de crestere studiati nu induce diferentierea celulelor in CMCs.
In plus, tratamentul CSM cu TGFb1/3 a determinat o activare puternica a expresiei genice a cistation-g-liazei (CGL), enzima implicate in producerea de H2S, cunoscut protector miocardic. Acest lucru s-a mentinut nu numai in conditii normale, ci si hipoxice. In acord cu scaderea expresiei de CGL observata in miocardul ischemic adult in vivo (in etapa 1 a proiectului), cresterea expresiei de CGL in CSM sub actiunea TGFb (factor care se gaseste in cantitati crescute in miocardul infarctizat) ar putea reprezenta o cale prin care CSM exercita efect protector.
Cu toate acestea, CSM pierd expresia de conexina 43 (proteina implicate in jonctiunile gap, necesare pentru cuplarea chimica si electrica a celulelor musculare cardiace in miocard) dupa tratamentul lor TGFb. Acest lucru ar putea defavoriza grefarea CSM inmiocard dupa transplantul celular, ceea ce ar putea explica efectul benefic tranzient observat in aceste cazuri.
Surprinzator, in prezenta de FGF, IGF si HGF, expresia conexinei 43 este crescuta foarte mult, ceea ce ar putea duce la o noua strategie de terapie celulara si anume, prin tratarea celulelor cu FGF inainte de transplantarea lor. Astfel, tratamentul celulelor cu FGF, dincolo de modificarea morfologica pe care o induce in CSM, determina o expresie foarte crescuta de conexina 43 pe suprafata celulelor, ceea ce ar facilita grefarea celulelor dupa transplant. Odata ajunse in miocard, CSM intalnesc TGFb, care le induce o expresie crescuta de CGL, ceea ce determina o secretie de H2S in miocard, cu efect protector.
Cu privire la CSE, natura lor pluripotenta a determinat un mare interes in randul cercetatorilor din intreaga lume pentru a le utiliza ca sursa de celule in diferite strategii de regenerare tisulara, pentru terapia unor boli degenerative severe, precum insuficienta cardiaca. Astfel, aceste celule sunt privite ca o sursa reinnoibila permament de cardiomiocite, care ar fi dificil de obtinut din alte tipuri celulare.
Este cunoscut faptul ca diferentierea in vitro a CSE presupune formarea unor structuri tri-dimensionale tranziente, numite corpi embrioizi, care recapituleaza intr-o oarecare masura procesul de gastrulare in vivo. Astfel, similar cu embriogeneza in vivo, in interiorul corpilor embrioizi se stabilesc interactii celulare reglate atat spatial, cat si temporal, care determina formarea celulelor precursoare si diferentierea lor ulterioara in tipuri celulare diferentiate. Deoarece agregarea CSE in corpi embrioizi este, totodata, si primul stagiu din diferentiere in care poate fi generata heterogenitatea, metodele de agregare care duc la formarea corpilor embrioizi sunt foarte importante. De aceea, in aceasta etapa ne-am ocupat cu dezvoltarea unui protocol de agregare care sa permita diferentierea celulara controlata prin limitarea variatiilor in marimea corpilor embrioizi. Pentru aceasta, am testat daca prezenta serului fetal bovin (SFB) si al inlocuitorului de ser (KO-SR, knock-out serum replacement) au efect asupra marimii corpilor embrioizi generati in vitro si asupra capacitatii lor de a genera cardiomiocite (CMCs).
Pentru aceste studii, am lucrat cu CSE obtinute de grupul nostru din soareci RAP. Aceste celule au fost caracterizate, stabilindu-se apartenenta lor la tipul de celule stem embrionare (vezi figura 1) prin demonstrarea morfologiei lor caracteristice si a prezentei markerilor specific.
Figura 1. Caracterizarea CSE. a) Microscopie in contrast de faza, ilustrand aspectul caracteristic al coloniilor de CSE nediferentiate pe substrat feeder de fibroblasti embrionare inactivati mitotic. b) Microscopie de fluorescenta ilustrand expresia nucleara de Oct-4 in CSE, dar nu in celulele feeder. c) Microscopie de fluorescenta ilustrand expresia de SSEA-1, marker specific CSE murine, numai pe suprafata CS, nu si a celulelor feeder.
Potentialul pluripotent al acestor celule a fost demonstrat prin experimente in vivo, in care s-a urmarit capacitatea acestor celule de a induce teratoame. Pentru aceasta, ~un milion CSE au fost injectate subcutan in soareci adulti, iar tumorile crescute dupa 3 saptamani au fost analizate histologic, prin colorare cu hematoxilin-eozina. Rezultatele au aratat capacitatea acestor celule de a genera in vivo celule diferentiate apartinand tuturor celor trei foite embrionare (figura 2).
Figura 2. Coloratie cu hematoxin-eozina a unui teratom derivat prin injectarea subcutanata a CSE in soareci singenici. Sunt ilustrate cu sageti structuri de epiteliu neuronal (derivat din ectoderm), muschi neted (derivat din mezoderm) si epiteliu ciliat pseudo-stratificat columnar (derivat din endoderm).
Pentru a evalua modul in care asamblarea corpilor embrioizi afecteaza decizia de diferentiere si potentialul CSE de a genera CMCs, am utilizat trei metode diferite de generare a corpilor embrioizi (sumarizate in figura 3).
Figura 3. Ilustrarea schematica a protocoalelor utilizate pentru diferentierea in vitro a CSE. Corpii embrioizi au fost obtinuti prin 3 metode diferite si diferentierea CSE din fiecare tip de corp embrioid a fost urmarita timp de 18 zile.
In primul protocol de diferentiere testat, celulele au fost lasate sa agrege in mediu de diferentiere in prezenta de SFB pe placi bacteriene (care nu favorizeaza aderarea celulelor). Dupa 5 zile de la initierea diferentierii, corpii embrioizi rezultati au fost mutati pe placi de 24 godeuri acoperite cu gelatina (1 corp embrioid/godeu) si celulele au fost lasate sa-si finalizeze diferentierea pana in ziua a 18-a. Rezultatele au demonstrat formarea unor corpi embrioizi cu marime variabila intr-un interval larg (figura 4a).
Figura 4. Diferentierea CSE utilizand primul protocol de diferentiere. a) Aspectul corpilor embrioizi dupa 5 zile de dezvoltare pe placi bacteriene in prezenta de SFB. b) Microscopie in contrast de faza ilustrand o colonie contractila aparuta dintr-unul din corpii embrioizi mari. c) Microscopie in contrast de faza ilustrand o colonie de celule asemanatoare cu CSE (CSE-like) aparuta dintr-unul din corpii embrioizi mici dupa 10 zile de diferentiere. d) RT-PCR ilustrand expresia de Oct-4, Nanog si GATA-4 in CSE nediferentiate (1) si in colonia de celule CSE-like (2). Drept controale, s-au folosit celule fibroblaste embrionare (3), celule din maduva osoasa (4) si tesut cardiac adult (5). Este evidenta absenta expresiei genice pentru genele specifice celulelor pluripotente (oct-4 si nanog) in lane-urile 3-5.
Acesti corpi embrioizi au fost in continuare delimitati in funtcie de marimea lor, in corpi embrioizi mari si corpi embrioizi mici, si evaluati individual din punct de vedere al capacitatii lor de a genera CMCs. Rezultatele au aratat ca toti corpii embrioizi mari au dat nastere la celule contractile pana in ziua 8 de diferentiere (figura 4b). In schimb, corpii embrioizi mici au generat celule epithelial-like, care s-au intins ca un monostrat de celule feeder. In ziua a 8-a de diferentiere, din aceste celule epithelial-like au aparut colonii de celule rotunde, care au continuat sa creasca pe monostratul generat de celulele epithelial-like, precum CSE nediferentiate pe strat feedre de fibroblasti (figura 4c). Examinarea morfologica a acestor colonii a relevat aspectul lor mai turtit, comparativ cu CSE nediferentiate. Analiza prin RT-PCR a aratat ca aceste celule expreima atat markeri de pluripotenta (oct-4 si nanog), cat si markeri specifici diferentierii cardiace (GATA-4) (figura 4d). Cu toate acestea, nici una din aceste colonii nu a generat celule contractile pana in a 18-a zi de diferentiere. Aceste rezultate demonstreaza ca numarul initial de celule care se asambleaza in corpi embrioizi este un factor critic in decizia privin diferemntierea CSE in CMCs.
Pentru un control riguros al numarului de CSE care genereaza un corp embrioid, numere definite de CSE (200, 500, 1000, 2000) au fost lasate sa agrege in mediu de diferentiere in prezenta de SFB, utilizand metoda hanging-drop (aceasta metoda permita formarea unor agregate celulare de marime uniforma). Dupa 2 zile de diferentiere in hanging-drop, agregatele celulare au fost mutate pe placi bacteriene si crescute inca 3 zile in suspensie cu agitare. Din ziua a 5-a de diferentiere, corpii embrioizi au fost transferati pe placi de 24 godeuri (1 corp embrioid/godeu), urmarindu-se dezvoltarea ariilor contractile pana in ziua 18 de diferentiere. Agregarea unor numere definite de CSE in hanging-drop a avut ca rezultat formarea unor corpi embrioizi a caror marime a fost direct corelata cu numarul initial de celule (figura 5).
Analiza prin RT-PCR a corpilor embrioizi rezultati dupa 6 zile de diferentiere in vitro a relevat pierderea markerilor de pluripotenta (oct-4, rex, nanog) si activarea expresiei unor gene caracteristice celulelor derivate din toate cele trei straturi germinale, indiferent de numarul initial de celule care a generat corpul embrioid (Figura 6a).
Figura 5. Morfologia corpilor embrioizi obtinuti dupa 3 zile de la agregarea a 200, 500, 1000 si 2000 CSE utilizand protocolul II de diferentiere.
In ceea ce priveste dezvoltarea contractilitatii, s-a observat ca toti corpii embrioizi derivati din 2000 CSE si 91% din cei derivati din 1000 CSE arata contractii in ziua a 7-a de diferentiere (Figura 11b). In schimb, s-a observat o intarziere considerabila in aparitia contractilitatii in corpii embrioizi derivati din 500 celule si doar 6% din ei ajung sa dezvolate contractilitate pana in ziua a 18-a. Aceste date sugereaza ca relatiile intercelulare stabilite in interiorul corpilor embrioizi influenteaza soarta celuleor si numarul de corpi cu contractilitate.
Figura 6. a) RT-PCR din corpii embrioizi obtinuti dupa 6 zile, ilustrand prezenta markerilor de pluripotenta si a markerilor specifici pt endoderm (AFP), ectoderm (Tuj-1) si mezoderm (GATA-4). Fibroblastii embrionari si inima adulta au fost utilizate drept control negativ pentru markerii de pluripotenta si control pozitiv pt GATA-4. b). Diagrama ilustrand dezvoltarea corpilor contractili in functie de numarul initial de CSE care se agrega in vitro. Se observa ca corpii embrioizi generati din 1000 CSE sau mai multe prezinta contractilitate incepand din ziua a 7-a de diferentiere, in timp ce contractilitatea dezvoltata de corpii embrioizi generati din 500 sau mai putine celule este doar ocazionala si mult intarziata.
Agregarea a 200 si 500 CSE in hanging drop, insa in prezenta de KO-SR in loc de SFB (conditia III de diferentiere in vitro) a generat agregate celulare cu marimi omogene, similar cu conditia II de diferentiere (Figura 7
Figura 7. Diferentierea CSE in prezenta de KO-SR. a) Morfologia corpilor embrioizi la 3 zile de la agregarea a 200 si 500 CSE in hanging-drop in prezenta de KO-SR. Se observa corelatia directa dintre numarul initial de celule si marimea corpilor embrioizi. b) Microscopie in contrast de faza pentru ilustrarea comparativa a gradului de compactare si marimii corpilor embrioizi derivati din agregarea a 500 CSE in prezenta de SFB si KO-SR. c) Dezvoltarea in timp a contractilitatii in corpii embrioizi rezultati din 200 si 500 CSE in mediu continand KO-SR. Se observa ca nu exista diferenta in ceea ce priveste momentul aparitiei contractilitatii. d) Dezvoltarea in timp a contractilitatii in corpii embrioizi rezultati din agregarea a 500 CSE in prezenta de SFB si KO-SR. Se observa un procent crescut de corpi contractili in prezenta de KO-SR decat in prezenta de SFB.
Cu toate acestea, corpii embrioizi initiati in prezenta de KO-SR au fost mai mici si mai putin compactati, comparativ cu cei initiati in prezenta de SFB, sugerand o progresie mai lenta a dezvoltarii. (Figura 7b). In ciuda dezvoltarii intarziate a corpilor embrioizi generati in prezenta de KO-SR, acestia au generat un procent mai mare de corpi contractili (Figura 7c, d). Astfel, din corpii embrioizi obtinuti prin agregarea a 500 CSE in KO-SR, 85% au prezentat contractilitate, comparativ cu doar 6% in cazul corpilor embrioizi formati in prezenta de SFB.
Aceste rezultate sugereaza ca KO-SR influenteaza agregarea CSE in corpii embrioizi, avand ca rezultata corpi embrioizi mai putin compacti, ceea ce poate avea impact asupra dezvoltarii cardiace. In acest sens, este probabil ca o compactare solida ininteriorul unui corp embrioid poate duce la necroza celulelor din mijloc, cu impact asupra viabilitatii si diferentierii celulare. Alternativ, o aglomerare mai mica a celulelor poate crea conditii optime de interactii celulare si semnalizari propice necesare diferentierii cardiace. Datele noastre demonstreaza faptul ca utilizarea KO-SR in timpul asamblarii corpilor embrioizi are ca rezultat accelerarea diferentierii CSE in CMCs si o crestere procentuala a corpilor embrioizi care genereaza contractilitate prin diferentierea in vitro.
