Proiect : PN-III-P4-PCE-2021-1755

A novel anti-atherosclerotic chimeric protein for prevention the inflammatory cells infiltration in the atheromatous plaque

O nouă proteină himerică anti-aterosclerotică pentru prevenirea infiltrării celulelor inflamatorii în placa ateromatoasă

Acronim: FasTrap

Contract 124/2022

Director proiect : Dr. Anca Violeta Gafencu

Finantare: 1.200.000 lei

Rezumat

Bolile cardiovasculare, în special ateroscleroza, reprezintă o problemă majoră de sănătate, fiind principala cauză de mortalitate la nivel global. Ateroscleroza este o boală a arterelor, în care se formează plăci ateromatoase care blochează fluxul sanguin. Această afecțiune are și o componentă inflamatorie: pereții vaselor de sânge devin activati, exprimând molecule care atrag celule immune, care trec de primul strat de celule al peretelui vaselor de sange si se acumuleaza, se incarca cu lipide si ingroasa peretele vascular, contribuind la agravarea bolii.

Proiectul nostru propune o nouă abordare pentru tratamentul aterosclerozei prin livrarea unei gene terapeutice folosind vectori lentivirali. Această genă produce o proteină special concepută, formată din două componente: o parte care ajută la fixarea proteinei pe vasele de sânge afectate si o parte care care declanșează moartea programată (apoptoza) a celulelor imune care tind sa se infiltreze in placa aterosclerotica.

Astfel, molecula imaginata va functiona ca un gardian care nu va permite strapungerea stratului protector al vasului de sange. Ca urmare, celulele immune in loc sa patrunda in peretele vasului si sa contribuie la formarea placii aterosclerotice, ele vor fi eliminate, evitandu-se inflamația și prevenind progresia aterosclerozei. Astfel, tratamentul poate aduce beneficii sociale și economice importante, îmbunătățind calitatea și durata vieții pacienților.

Figura 1. Ipoteza proiectului. Molecula himerica asigură agregarea și oligomerizarea ligandului care induce moartea celulara la suprafața endoteliului activat permițând interacțiunea cu receptorul său exprimat pe celulele inflamatorii care se infiltrează în placa ateromatoasă. Această interacțiune va induce apoptoza celulelor imune infiltrante, va reduce formarea celulei de incarcate cu lipide din placa aterosclerotica și va opri progresia aterosclerozei.

Rezultate obtinute:

In prima etapa am obținut vectorii lentivirali. Deoarece vectorul pLION (Figura 2 stânga) a fost ineficient in impachetarea lentivirusului, am obținut vectorul pCHD in care am introdus gena care codifica molecula himerică. (Figura 2 dreapta):

1.pCDH-CMV-VBP-sFasL;

2. pCDH-VCAM-sFasL;

Figura 2. Plasmidele utilizate pentru inducerea expresiei moleculei himerice

Celulele transduse exprima o proteina verde fluorescenta, ca reporter. Fluorescenta in verde creste cu cat celulele sunt tratate cu cantitati mai mari de lentivirus. Astfel, se poate determina titrul (concentratia) lentivirusului.

Figura 3 . Celule transduse cu lentivirus in cantitati diferite

Lentivirusurile cu vectorii de expresie au fost impachetati si purificati. Pe baza moleculei reporter GFP, virusurile impachetate au fost titrate prin citometrie in flux (Fig.4)

Figura 4.Titrarea prin citometrie de flux. In functie de cantitatea de virus folosita se observa inducerea expresiei proteinei fluorescente verzi, care este inregistrata sub forma unui pisc (colorat in negru).

Au fost obtinute rezultate despre potentialul moleculei himere de a se lega de suprafata celulelor endoteliale activate, prin intermediul VCAM1 si de a induce apoptoza in celulele care prezinta receptorul Fas. Pentru aceasta au fost obtinute clone de celule care secreta in mediu de cultura himera de interes (Figura 5).

Fig 5. Celule transduse exprimă atât proteina verde (reporter) exprimă și proteina himerică de interes, colorată cu anticorpi marcați fluorescent în roșu

Am demonstrat ca proteina himerică este activă si poate induce moartea celulară a celulelor care exprima receptorul specific prin mai multe metode. Mai jos este prezentata determinarea apoptozei prin citometrie in flux (Figura 6).

Figura 6. Apoptoza indusă de proteina himerică. Procentul de celule apoptotice este evidențiat în demarcajul roșu.

Am demonstrat ca proteina himerică este se poate lega de celulele endoteliale activate, folosindu-se celule din linia EAHy 926. În Figura 7 se observă proteina colorată în roșu legată la suprafața celulelor endoteliale (dreapta), față de celulele neincubate cu proteina respectivă (control, stânga).

Figura 7. Legarea proteinei himerice la suprafata celulelor endoteliale.

Am demonstrat că aeastă proteină himerică formată din două componente: o parte care ajută la fixarea proteinei pe vasele de sânge afectate și o parte care declanșează moartea programată (apoptoza) poate induce apoptoza celulelor imune care tind să se infiltreze iî placa aterosclerotică

ECHIPA DE IMPLEMENTARE

Activitati de diseminare si alte rezultate

Rezultatele obtinute in cadrul proiectului au fost incluse in 2 teze de master (Oana Mirancea si Marius Multescu)
Un membru al echipei, Irina Tudurache, a obtinut titlul de doctor
A fost depus si publicat brevetul: O metoda eficienta de purificare a lentivirusurilor utilizate ca vectori de livrare a genelor sau a altor fragmente de acizi nucleici
A fost trimis spre publicare articolul Unravelling molecular mechanisms in atherosclerosis using cellular models and omics technologies, VASCULAR PHARMACOLOGY, 2024
A fost prezentat posterul An Efficient Strategy of Lentivirus Production for in vivo Applications, autori Marius Mulțescu, Mădălina Dumitrescu, Irina Tudorache, Irina Bucă, Mădălina Fenyo, Elena Fuior, Radu Ioniță, Gabriela Florea, Anca Gafencu la simpozionul international: The 40th Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology Bucuresti, 16-17 noiembrie 2023
In cadrul simpozionului The first COST Action CA21153 AtheroNET meeting organizata la Bucuresti in perioada 22-24 martie 2023, Dr. A. Gafencu a prezentat proiectul si date obtinute pana la momentul respectiv in prelegerea Molecular engineering for therapeutic purposes.
In cadrul vizitei de lucru la Universitatea din Milano din ianuarie 2023, Dr. A Gafencu a facut o prezentare orala a rezultatelor in prelegerea Anti-atherosclerotic molecular hibrids.
Rezultate din proiect vor fi prezentate in posterul Apoptotic potential of targeted apo-1 ligand la A 41-a Sesiune Științifică Anuală a Societății Române de Biologie Celulară, Târgu Mureș, 13-14 decembrie 2024
Rezultate din proiect vor fi prezentate la Simpozionul Aniversar cu participare Internationala CELLebrare: IBPC-NS - 45 DE ANI DE ACTIVITATE “Aspirație, inspirație și inovațe în cercetarea biomedicală”, 17-18 decembrie Bucuresti, 2024

Grantul a oferit suport pentru specializari in strainatate suportate de proiect:

-Gabriela Florea si Irina Tudorache, studente la doctorat din echipa de proiect au participat la Scoala de vara CardioSCOPE organizata de Facultatea de farmacie, Universitatea din Belgrad, 16-20 iulie 2023, unde au discutat cu ceilalti participanti despre rezultatele obtinute in proiect

-Irina Tudorache a participat la Training school Omics for Precision Medicine in ASCVD

-Elena Fuior a participat la cursul practic Oroboros O2k-Workshop on high-resolution respirometry