Networking & Grants  »  Grants  »  National Grants
CARDIOCRISPR
 

RO

 

GRANT acordat de Autoritatea Națională pentru Cercetare Științifică și Inovare, CNCS-UEFISCDI

PROGRAMUL P2 Creșterea competitivității economiei românești prin CDI

TIP PROIECT Proiect experimental demonstrativ (PED)

 

COD PROIECT PN-III-P2-2.1-PED-2021-1929

CONTRACT PED-640/2022

TITLU PROIECT

Demonstrație experimentală a unei biotehnologii inovatoare care utilizează activarea transcripțională cu CRISPR/dCas9 pentru îmbunătățirea funcției HDL ca terapie în bolile cardiovasculare

ACRONIM CARDIOCRISPR

PERIOADA 23.iun.2022 – 21.iun.2024 (24 luni)

BUGET 600.000 LEI

COORDONATOR Institutul de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu“ (IBPC-NS)

DIRECTOR DE PROIECT Dr. Camelia S. STANCU

ECHIPA DE CERCETARE

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Ing. Mariana Deleanu, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo, Drd. Teodora Barbălată, As. Daniela Rogoz, As. Cristina Dobre

 

REZUMAT

Disfuncția metabolismului lipidic, stresul oxidativ și inflamator sunt factori critici de risc ai aterosclerozei, principala cauză a bolilor cardiovasculare (CVD). Lipoproteinele de densitate mare (HDL) au rol atero-protector prin transportarea excesului de colesterol de la țesuturile periferice la ficat pentru excreție, precum și datorită efectelor anti-oxidante și anti-inflamatoare. HDL sunt secretate de hepatocite, eficiența lor depinzând de conținutul și calitatea proteinelor lor majore, apolipoproteina AI (apoAI) și enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1), și de interacția lor cu transportorul A1 cu legare de ATP (ABCA1) din membrana celulară. În CVD, aceste proteine sunt oxidate și HDL devin disfuncționale. Încercările de a crește cantitativ HDL prin injectarea apoAI intravenos a avut efecte benefice limitate la pacienții CVD, terapia fiind oprită datorită costurilor excesive. Sistemul grupărilor de repetiții scurte palindromice interspațiate sistematic și proteina 9 dezactivată asociată lor (CRISPR/dCas9) poate activa eficient și specific orice secvență de ADN genomic, fără efecte secundare nocive. Astfel, tehnologia CRISPR/dCas9 este acum unul dintre cele mai puternice instrumente de editare genică. Scopul acestui proiect este de a dezvolta și valida in vitro și in vivo o metodă noua și accesibilă pentru creșterea cantității și funcției HDL cu scopul de a stabiliza sau regresa leziunile aterosclerotice. Originalitatea proiectului consta în supra-exprimarea simultană a proteinelor HDL endogene apoAI, PON1 și ABCA1 în hepatocite. Abordarea inovatoare a proiectului consta în utilizarea tehnologiei CRISPR/dCas9 pentru activarea transcripției proteinelor cheie ale HDL in vitro. Pentru țintirea ficatului, plasmidele CRISPR/dCas9 vor fi combinate cu sistemul in vivo-jetPEI pentru a determina sinteza HDL funcționale la șoarecele cu ateroscleroză. Proiectul va dezvolta o terapie genică inovatoare pentru a regresa CVD, cu puternic impact socio-economic.

        

ENG

 

GRANT awarded by the Romanian National Authority for Scientific Research and Innovation

PROGRAME P4 Increasing the competitivity of Romanian economy by research, development and innovation

PROJECT TYPE Experimental-demonstrative project

 

PROJECT CODE PN-III-P2-2.1-PED-2021-1929

CONTRACT No. PED-640/2022

PROJECT TITLE

Experimental demonstration of an innovative biotechnology using CRISPR/dCas9 transcriptional activation to improve HDL function as therapy for cardiovascular diseases

ACRONYM CARDIOCRISPR

PERIOD 23.Jun.2022 – 21.Jun.2024 (24 months)

BUDGET 600,000 RON

COORDINATOR Institute of Cellular Biology and Pathology „Nicolae Simionescu“ (ICBP-NS)

PROJECT LEADER Dr. Camelia S. STANCU

RESEARCH TEAM

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Ing. Mariana Deleanu, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo, Drd. Teodora Barbalata, As. Daniela Rogoz, As. Cristina Dobre

 

 

 ABSTRACT

The lipid metabolism dysfunction, and oxidative and inflammatory stress are critical risk factors for atherosclerosis, the main cause of cardiovascular diseases (CVD). High density lipoproteins (HDL) play athero-protective role by transporting the excess cholesterol from the peripheral tissues to the liver for excretion, having anti-oxidant and anti-inflammatory effects. HDL are secreted by hepatocytes, their efficacy depending on the content and quality of the major proteins, apolipoprotein AI (apoAI) and antioxidant enzyme paraoxonase 1 (PON1), and their interaction with the cellular membrane ATP binding cassette A1 (ABCA1) transporter. In CVD conditions, these proteins become oxidized and HDL dysfunctional. The attempts to increase HDL quantity based on apoAI intravenous injection had limited beneficial effects in CVD patients, this therapy being stopped due to the excessive cost. The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and their associated deactivated protein 9 system (CRISPR/dCas9) can activate any genome DNA sequence with high efficiency and specificity, and without hazardous side effects, thus making this technology one of the most powerful gene-editing tools now. The aim of this project is to develop and validate in vitro and in vivo a novel and affordable method to increase HDL quantity and function to achieve stabilization or regression of the atherosclerotic lesions. The originality of this proposal lies in the simultaneous overexpression of endogenous HDL proteins apoAI, PON1 and ABCA1 in hepatocytes. The innovative approach of the project consists in employing CRISPR/dCas9 technology to activate the transcription of HDL key proteins in vitro. For liver targeting, the CRISPR/dCas9 plasmids will be combined with in vivo-jetPEI® delivery system to determine functional HDL synthesis in a mouse model of atherosclerosis. The project will develop innovative gene therapy to regress CVD, with valuable socio-economic impact.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ETAPA 1 - 2022

  • Obţinerea de celule hepatocite care supraexprimă apolipoproteina AI (apoAI), enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1) şi transportorul ABCA1.

 

Rezumat

Disfuncţia metabolismului lipidic, stresul oxidativ şi inflamator sunt factori critici de risc ai aterosclerozei, principala cauză a bolilor cardiovasculare. Lipoproteinele de densitate mare (HDL) au rol atero-protector prin transportarea excesului de colesterol de la ţesuturile periferice la ficat pentru excreţie, precum şi datorită efectelor anti-oxidante şi anti-inflamatoare. HDL sunt secretate de hepatocite, eficienţa lor depinzând de conţinutul şi calitatea proteinelor lor majore, apolipoproteina A1 (APOA1) şi enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1), şi de interacţia lor cu transportorul A1 cu legare ATP (ABCA1) din membrana celulară. În bolile cardiovasculare, aceste proteine sunt oxidate şi HDL devin disfuncţionale. Încercările de a creşte cantitativ HDL prin injectarea apoAI intravenos a avut efecte benefice limitate la pacienţii cu boli cardiovasculare, terapia fiind oprită datorită costurilor excesive. Scopul acestui proiect este de a dezvolta şi valida in vitro şi in vivo o metodă nouă şi accesibilă pentru creşterea cantităţii şi funcţiei HDL cu scopul de a stabiliza sau regresa leziunile aterosclerotice. Pentru atingerea acestui scop am supra-exprimat proteinele endogene implicate în producerea HDL funcţionale şi anume APOA1, PON1 şi ABCA1 în hepatocite. În această primă etapă a proiectului am testat diferite condiţii experimentale pentru a optimiza supra-exprimarea proteinelor APOA1, PON1 şi ABCA1 în celule hepatocite. Rezultate: am obţinut supra-exprimarea celor trei proteine ţintă şi am stabilit condiţiile optime pentru fiecare în parte. Am evaluat apoi expresia genică a unor proteine implicate în sinteza de lipide şi metabolizarea acestora la nivel hepatic. Am obţinut că supra-exprimarea APOA1 şi ABCA1 reduc expresia genică a enzimei cheie implicate în sinteza colesterolului endogen şi cresc expresia genică a enzimelor implicate în metabolizarea colesterolului şi efluxul lui. Toate activităţile prevăzute pentru această etapă a proiectului au fost realizate.

 

Sumar al progresului și Concluzii

  • Am stabilit condiţiile optime pentru supra-exprimarea ABCA1, APOA1 şi PON1 în celule hepatocite;
  • Secreţia proteinelor APOA1 şi PON1 în mediul de cultură al celulelor transfectate creşte > 20%;
  • Supra-exprimarea proteinelor APOA1 şi ABCA1 în hepatocite reduce expresia genică a enzimei cheie implicată în sinteza colesterolului endogen şi induce creşterea expresiei genice a transportorului de colesterol responsabil pentru efluxul acestuia în sucul biliar;
  • Supra-exprimarea proteinei APOA1 în hepatocite induce creşterea expresiei genice a enzimelor implicate în metabolizarea colesterolului prin transformarea lui în acizi biliari.
  • Supra-exprimarea proteinelor APOA1 şi ABCA1 în hepatocite nu a influenţat expresia genică a enzimelor implicate în sinteza acizilor graşi.

 

ETAPA 2 - 2023

  • Evaluarea efectului protector al proteinelor secretate de hepatocitele care supraexprimă apolipoproteina AI (apoAI), enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1) sau transportorul ABCA1 asupra celulelor endoteliale (CE) activate pro-inflamator.
  • Supraexprimarea proteinelor endogene apoAI/PON1/ABCA1 cu plasmide CRISPR/dCas9 într-un model experimental de şoarece.

 

Rezumat

Ateroscleroza este principala cauză a bolilor cardiovasculare şi prezintă ca factori de risc disfuncţia metabolismului lipidic, stresul oxidativ şi cel inflamator. Lipoproteinele de densitate mare (HDL) sunt secretate de hepatocite şi au rol atero-protector datorită efectelor anti-oxidante şi anti-inflamatoare şi eliminării excesului de colesterol de la ţesuturile periferice la ficat pentru excreţie. Funcţionalitatea HDL depinde foarte mult de conţinutul şi calitatea proteinelor lor majore, apolipoproteina A1 (APOA1) şi enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1), şi de interacţia lor cu transportorul A1 cu legare ATP (ABCA1) din membrana celulară. Scopul acestei etape a proiectului a fost de a realiza o serie de teste funcţionale care să evidenţieze potenţialul procedurii de supra-exprimare a proteinelor PON1, apoAI şi ABCA1 prin metoda CRISPR/dCas9 de a creşte funcţionalitatea HDL. Pentru atingerea acestui scop am supra-exprimat aceste proteine în hepatocite şi am evaluat potentialul protector al mediului condiţionat (MC) de la celulele transfectate asupra celulelor endoteliale activate pro-inflamator cu TNFα. Rezultate: am evidenţiat proprietăţile antioxidante ale MC de la hepatocite care supra-exprimă proteinele ţintă exercitate prin scӑderea proteinei pro-oxidante p22phox (în cazul PON1) sau stimularea proteinei antioxidante PON2 (în cazul APOAI/PON1/ABCA1). Proprietăţile anti-inflamatorii ale MC de la hepatocitele transfectate au constat în reducere expresiei VCAM-1 şi MCP-1 în celulele endoteliale activate cu TNFα şi reducerea adeziunii monocitelor la acestea. Am reuşit supra-exprimarea PON1 în ficatul şoarecilor C57Bl/6J şi creşterea activităţii enzimatice în serul acestora. Rezultatele obţinute în acestă etapă au fost prezentate la o conferinţă internaţională şi o parte din date au fost publicate într-o lucrare aparută în revistă indexată ISI (web of science core collection).

 

Sumar al progresului și Concluzii

  • Supra-exprimarea proteinelor APOA1, PON1 şi ABCA1 în hepatocite a indus mediului condiţionat proprietati antioxidante în celulele endoteliale activate cu TNFα, prin mecanisme legate de scӑderea proteinei pro-oxidante p22phox (în cazul supra-exprimarii PON1) sau de stimulare a proteinei antioxidante PON2 (la supra-exprimarea APOAI/PON1/ABCA1);
  • Supra-exprimarea ApoAI în hepatocitele umane a indus mediului condiţionat proprietăţi anti-inflamatorii capabile sӑ reducӑ expresia VCAM-1 şi MCP-1 în celulele endoteliale activate cu TNFα;
  • Supra-exprimarea ABCA1 şi PON1 în hepatocitele umane a potenţat mediul condiţionat al acestor celule cu proprietăţi anti-inflamatorii capabile sӑ reducӑ adeziunea monocitelor la celulele endoteliale activate cu TNFα;
  • Mediul condiţionat de la hepatocitele care supra-exprimă APOAI/PON1/ABCA-1 nu a prezentat proprietӑti anti-apoptotice  pentru celulele endoteliale activate cu TNFα;
  • Am reuşit creşterea activităţii PON1 în serul şoarecilor C57Bl/6J injectaţi cu plasmide CRISPR/dCas9 de activare pentru PON1 comparativ cu plasmide control;
  • Expresia genică şi proteică a PON1 a crescut în ficatul şoarecilor C57Bl/6J injectaţi cu plasmide CRISPR/dCas9 de activare pentru PON1 comparativ cu plasmide control, în timp ce expresia apoAI nu s-a modificat.

 

Diseminarea rezultatelor

  •  Am publicat o lucrare într-o revistă indexată ISI (2022 IF 5,5, Q1):

Toma L., Sanda G.M., Stancu C.S., Niculescu L.S., Răileanu M., Sima A.V. Oscillating Glucose Induces the Increase in Inflammatory Stress through Ninjurin-1 Up-Regulation and Stimulation of Transport Proteins in Human Endothelial Cells. Special Issue: Recent Advances in Cellular and Molecular Mechanisms of Cardiovascular and Metabolic Diseases. Biomolecules 13(4): 626, 2023; doi: 10.3390/biom13040626 (2022 IF 5,5, Q1). 

  • Am participat la Conferința Internațională 40th Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB) cu o comunicare cu Poster:

Laura Toma, Gabriela M. Sanda, Elena V. Fuior, Jessica Ciobanu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. CRISPR/dCas9 Gene Editing to Overexpress Apolipoprotein AI, the Antioxidant Enzyme Paraoxonase 1 and the Cholesterol Transporter ABCA1 in Human Hepatocytes - an Advanced Source of Functional HDL. Bulletin of RSCB, volume 48, November 2023.

 

ETAPA 3 - 2024

  • Estimarea calității HDL și a efectelor anti-aterosclerotice la șoarecii care supra-exprimă proteinele apoAI/PON1/ABCA1.

 

Rezumat

Lipoproteinele de densitate mare (HDL) sunt secretate în principal de hepatocite şi au rol protector împotriva aterosclerozei datorită efectelor anti-oxidante şi anti-inflamatoare şi eliminării excesului de colesterol de la ţesuturile periferice la ficat pentru excreţie. Funcţionalitatea HDL depinde foarte mult de conţinutul şi calitatea proteinelor lor majore, apolipoproteina A1 (apoA1) şi enzima antioxidantă paraoxonaza 1 (PON1) şi de interacţia lor cu transportorul A1 care leaga ATP (ABCA1) din membrana celulară. Scopul acestei etape a proiectului a fost de a realiza activarea transcripțională in vivo a proteinelor PON1, apoAI şi ABCA1 prin metoda CRISPR/dCas9 pentru a creşte funcţionalitatea HDL. Pentru atingerea acestui scop am realizat un studiu-pilot în care am injectat plasmide de activare a transcripției PON1 la şoareci C57Bl/6J. Pe baza rezultatelor promițătoare obținute, am injectat ulterior la șoareci  apoE deficienți (apoE-/-) plasmidele de activare pentru PON1, apoAI sau ABCA1. Rezultate: Am reuşit supra-exprimarea PON1 în ficatul şoarecilor C57Bl/6J şi creşterea activităţii enzimatice în serul acestora. La șoarecii apoE-/- am reușitsă obținem activarea ABCA1, iar în privința PON1 și apoAI rezultatele au fost promițătoare comparativ cu animalele sham, însă necesită confirmare comparativ cu animalele care au primit plasmide control. Supra-exprimarea proteinelor cheie implicate în funcționalitatea HDL au avute efecte pozitive asupra proteinelor implicate în sinteza acizilor grași, în transportul lipidelor la nivelul ficatului sau asupra celor responsabile de metabolizarea colesterolului. Adimistrarea palsmidelor de activare la șoarecii apoE-/- a indus o toxicitateîn proporție de 20-30% asociată mai degrabă cu vârsta și greutatea mici comparativ cu şoarecii C57Bl/6J. O parte din rezultatele promițătoare obţinute în acestă etapă au fost prezentate la o conferinţă internaţională iar manuscrisul care cuprinde toate datele obținute este în curs de redactare pentru a fi trimis spre publicare într-o revistă indexată ISI (web of science core collection). Am actualizat pagina web a proiectului pe pagina oficială a Institutului de Biologie şi Patologie Celulară „Nicolae Simionescu”. Activităţile prevăzute pentru această etapă a proiectului au fost realizate cu succes în proportie de 100%.

 

Sumar al progresului și Concluzii 

  • Activarea transcripţiei PON1 la şoarecii C57Bl/6J a determinat o creştere (15-20%) semnificativă a activităţii enzimatice ȋn ser, comparativ cu şoarecii control; expresia genică și proteică a crescut cu ~20% (NS);
  • Supra-exprimarea PON1 la şoarecii apoE-/- a indus o creştere cu 30% a nivelului seric al enzimei după 21 de zile de la injectare; creşterea activităţii enzimatice şi a expresiei genice/proteice necesită confirmare;
  • Activarea transcripțională a apoAI la şoarecii apoE-/- a indus o crestere semnificativă (>35%) a nivelului proteic al PON1, fiind cunoscut faptul că cele două proteine cheie din structura HDL se influențează reciproc;
  • Activarea transcripţiei apoAI la şoarecii apoE-/- nu a putut fi evaluată corect datorită lipsei şoarecilor control, dar există o tendinţă de creştere la nivelul ficatului, după 21 de zile de la injecţie, comparativ cu şoarecii sham;
  • Secreţia de apoAI ȋn serul şoarecilor apoE-/- a fost stimulată de supra-exprimarea PON1 şi ABCA1;
  • Supra-exprimarea transportorului ABCA1 la şoarecii apoE-/- s-a realizat cu succes, fiind indusă o creştere semnificativă (>40%) a expresiei genice şi proteice a transportorului la nivelul ficatului;
  • Activarea transcripțională a PON1, apoAI sau ABCA1 a indus creșterea nivelului seric al colesterolului total și scăderea concentrației de trigliceride la şoarecii apoE-/-, rezultat care ar putea constitui un indicator al descărcării colesterolului de la țesuturile periferice; leziunile aterosclerotice au fost însă într-un stadiu incipient care nu a permis detectarea unor diferențe semnificative între grupele de animale;
  • Supra-exprimarea ABCA1 la şoarecii apoE-/- a indus scăderea expresiei genice și proteice a enzimei FAS implicată în siteza acizilor grași;
  • Activarea transcripțională a PON1, apoAI sau ABCA1 la şoarecii apoE-/- a indus creșterea expresiei genice/proteice a transportorilor hepatici pentru colesterol ABCG8 și SR-BI;
  • Supra-exprimarea PON1, apoAI sau ABCA1 la şoarecii apoE-/- a indus creșterea expresiei genice/proteice a enzimei CYP7A1 implicată în metabolizarea colesterolului la acizi biliari;
  • Activarea transcripțională a proteinelor cheie implicate în funcționalitatea HDL cu ajutorul sistemului CRISPR/dCas9 este posibilă in vivo și poate induce efecte anti-aterosclerotice; această tehnologie necesită însă o foarte atentă adaptare a dozei de complexe ADN-jetPEI la organismul căruia urmează a fi administrată în acord cu vârsta, greutatea și patologia organismului, pentru a diminua posibilele efecte adverse.

 

 Diseminarea rezultatelor

  • Rezultatele obținute în cadrul proiectului au fost prezentate la prima ediție a conferinței internaționale „CRISPR Medicine Conference (CRISPRMED24)” care s-a desfășurat în Europa, la Copenhaga, Danemarca, în perioada 22-25 aprilie 2024. La această conferință am participat cu o comunicare ca poster:

Laura Toma, Gabriela M. Sanda, Elena V. Fuior, Jessica Ciobanu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. CRISPR/dCas9 gene editing for overexpressing apolipoprotein AI, paraoxonase 1 and cholesterol transporter ABC1 in hepatocytes - a promising tool to obtain functional HDL. CRISPRMED24 Abstract Book_2024-04-22, nr. 41.

  • Am publicat lucrarea intitulată „Bioactive Compounds Formulated in Phytosomes Administered as Complementary Therapy for Metabolic Disorders”, autori Toma L, Deleanu M, Sanda GM, Barbălată T, Niculescu LS, Sima AV, Stancu CS, în revista International Journal of Molecular Sciences, 2024 Apr 9;25(8):4162, doi: 10.3390/ijms25084162, factor de impact 5,6 (Q2).