:: En > En > Networking Grants > Grants > National Grants

Concept: As Therion is a renewed constellation, which includes a number of multiple stars, the acronym “THERION” has been chosen for this project, aiming to establish a novel, personalized preclinical in vitro cell transplantation model (Fig. 1) for validation of functional neovascularization induced at the level of cardiac tissue by endothelial colony-forming cells (ECFCs) engineered to express the most suitable constellation of vasculogenic PTPs.
Objectives: (i) to identify PTPs differentially expressed during commitment of umbilical blood and matrix-derived stem cells into ECFCs; (ii) to identify miRs that regulate expression of PTPs established to play key roles during ECFCs differentiation and their participation to vasculogenesis; (iii) to investigate at the functional level the capacity of the identified miR-PTP pairs to modulate ECFCs-induced neovascularization in cardiac tissue.

Prezentarea proiectului

Accelerarea transferului de informatii obtinute in laboratoarele de cercetare catre clinica necesita dezvoltarea unor modele in vitro de transplant celular si a unor tehnici noi de regenerare vasculara. Dintre celulele progenitoare, s-a demonstrat experimental ca endothelial colony-forming cells (ECFCs) pot contribui la regenerarea vasculara. Din pacate, in prezent nu exista modele pre-clinice capabile sa anticipeze rezultatul unei terapii clinice. De aceea, in cadrul acestui proiect, ne-am propus standardizarea in vitro a unui model de transplant celular capabil sa prezica potentialul angiogen al ECFC recoltate de la pacientii care necesita regenerare cardiovasculara. Acest model consta in co-cultivarea sectiunilor de miocard nativ (viabil) cu celule endoteliale progenitoare. Pentru a imbunatati eventualele efecte vasculogenice clinice, ne-am propus de asemenea, dezvoltarea unei metode celulare terapeutice care sa permita modificarea prin inginerie genetica a ECFCs, pentru a le imbunatati calitatile angiogenice. Printre reglatorii cheie ai proceselor biologice fundamentale, protein tirozin fosfatazele (PTPs), ca de exemplu RPTPmu, VE-PTP, PTP1B, TC-PTP, HD-PTP, CD148, SHP1/2, au fost implicate in controlul cresterii, proliferarii si adeziunii celulare, etape importante in procesul de angiogeneza/revascularizare, insa in prezent nu exista studii care sa fi adresat problema rolului PTPs in biologia ECFCs. Deoarece studii anterioare au demonstrat ca miR pot regla expresia unor PTP, in acest proiect ne-am propus modularea PTP-urilor din ECFCs prin actiunea miR. In acest sens, vom realiza o analiza sistematica a relatiei dintre PTP si miR in timpul diferentierii celulelor stem din cordon ombilical (sange sau matrice Warton), cu scopul identificarii perechilor miR-PTP implicate in procesul de remodelare cardiovasculara. La final, perechile miR-PTP identificate vor fi evaluate pe modelul de transplant celular in vitro, standardizat in acest proiect, pentru selectarea celor cu potential regenerativ.

Raportul fazei I (Sinteza)

(15 iulie 2012-15 noiembrie 2012)

Scopul proiectului este de a standardiza in vitro un model pre-clinic de re-vascularizare a miocardului ischemizat prin co-cultura sectiunilor de miocard nativ (viabil) cu celule endoteliale progenitoare. Modelul pre-clinic pentru transplantul celular presupune co-cultivarea in vitro, in absenta oricaror componente de origine non-umana, a unor sectiuni de miocard uman cu celule progenitoare, pentru testarea capacitatii acestora de a induce angiogeneza vasculara si regenerarea tisulara. Ipoteza de lucru are la baza efectele paracrine ale celulelor stem/progenitoare care, dupa transplantare in miocardul infarctizat, sunt capabile sa induca chemotaxia celulelor endoteliale mature aflate in situsuri invecinate cu regiunea infarctizata. Celulele endoteliale mature migrate la locul de infarct pot da nastere, prin grefare, activare, proliferare si migrare la noi vase capilare (neoangiogeneza) si pot, in consecinta, reface vascularizatia afectata de ischemie. Matrixul extracelular rezultat din remodelarea miocardica postinfarct poate actiona ca suport pentru grefarea celulelor endoteliale, cunoscute fiind expresiile crescute ale unor molecule matriceale (precum trombospondinele 1 si 2, tenascin C, osteopontina, periostinul, sindecanii, etc) in miocard dupa infarct.

Pentru realizarea acestui model in vitro, s-a pornit de la sectiuni de tesut miocardic uman viabil obtinute de la pacienti cu boala cardiaca ischemica. Recoltarea a fost realizata cu consimtamantul informat al pacientului si fara efecte secundare pentru pacient. Procedura de recoltare a fost autorizata de Directiunea CCUBC si de Comitetul de Bioetica al CCUBC.

Sectiunile tisulare au fost caracterizate prin coloratia tricroma Masson, utilizand un kit de la Richard-Allan Scientific. In urma acestei colorari, nucleii apar colorati in negru, fibrele mulculare si citoplasma in rosu, iar colagenul in albastru.

Este cunoscut faptul ca PTPazele reprezinta o superfamilie de enzime cu rol esential in transducerea semnalelor intracelulare. Impreuna cu protein tirozin kinazele, acestea controleaza gradul de fosforilare al proteinelor celulare. Superfamilia PTPazelor cuprinde 107 membri ce au fost clasificati in patru mari clase: i) PTPaze clasice, ii) PTPaze cu specificitate duala, iii) PTPaze cu masa moleculara mica si iv) PTPaze Eyes Absent (Alonzo et al., 2004). La randul lor, PTPazele clasice au fost subimpartite in doua grupuri: de tip non-receptor (citoplasmatice) si de tip receptor (transmembranare).

Conform primelor rezultate efectuate in cadrul proiectului, privind expresia a 8 PTPaze in miocardul uman afectat de boala ischemica, nivele lor de expresie difera semnificativ intre ele.

Cel de-al doilea component utilizat pentru standardizarea modelului nostru pre-clinic l-a constituit celula endoteliala progenitoare (CEP). Alaturi de celulele stem adulte (CSA), considerate ca celule progenitoare nediferentiate care raman intr-un organism dupa dezvoltarea embrionara, CEP sunt foarte mult utilizate in terapia regenerativa. Ele se gasesc predominant in sangele din cordon ombilical, dar si in maduva osoasa si circulatia periferica (Asahara et al, 1997), fiind derivate dintr-un progenitor comun intre celulele hematopoietice si celulele endoteliale, numit hemangioblast. Desi se pare ca nu se diferentiaza in CMC (Rubart si Field, 2006), CEP promoveaza angiogeneza si probabil furnizeaza semnale paracrine de supravietuire a CMC (Urbich et al, 2005). Utilizarea acestor celule in terapie a progresat in ultimii ani spre trialuri clinice cu rezultate preliminare dintre cele mai promitatoare (Schachinger et al, 2006).

In cadrul acestui proiect, am urmarit izolarea de CEP din sangele din cordonul ombilical uman, urmand o procedura descrisa de Medina et al., 2010. Caracterizarea celulelor s-a facut prin Flow citometrie si Microscopie confocala. Flow-citometria a urmarit caracterizarea imunofenotipica a celulelor, prin cuantificarea expresiei unor markeri specific endoteliali CD 31, CD144 si KDR. Rezultatele au aratat o expresie foarte puternica de CD31 (PECAM-1, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) pe suprafata CEP. De asemenea, celulele exprima pe suprafata lor CD144 (VE-Cadherina) si KDR (VEGFR2, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2). In paralel cu demonstrarea prezentei acestor markeri, s-a urmarit si cuantificarea expresiei CD14 (marker specific hematopoietic, prezent in special pe suprafata celulelor din linia monocitara), pentru demonstrarea absentei contaminantilor hematopoietici. Expresia crescuta de CD 31 a fost de asemenea confirmata si prin microscopie de fluorescenta. Tot prin microscopie confocala s-a demonstrat faptul ca celulele endoteliale progenitoare umane leaga lectina din Ulex europeus, o proteina cu afinitate specifica pentru zaharurile existente pe suprafata celulelor endoteliale.

Expresia genica a PTPazelor din CEP a fost, de asemenea, comparata cu expresia genica a PTPazelor intr-o linie stabila de celule endoteliale izolate din vena ombilicala umana (HUVEC, linia hEA hy926). Comparatia a fost posibila datorita amplificarii unor produsi specifici prin Real-time PCR, fapt demonstrat prin determinarea temperaturilor specifice de topire pentru fiecare produs amplificat. Astfel, temperatura de topire a fost practic identica in toate cele 3 probe analizate (miocard uman, HEP si hEA hy926).

In concluzie, in aceasta etapa a fost standardizata procedura de obtinere a feliilor (sectiuni obtinute la vibratom) de miocard uman si au fost obtinute si caracterizate celulele endoteliale progenitoare umane din sangele din cordon ombilical recoltat dupa nasteri normale. Atat probele de miocard uman, cat si celulele endoteliale progenitoare umane au fost analizate prin Real-time PCR pentru determinarea PTPazelor cu expresie crescuta. Desi o apreciere cantitativa comparativa intre cele trei tipuri de probe biologice (miocard uman, CEP si HUVEC) nu poate fi data, s-a putut face o comparatie intre gradele de expresie ale celor opt gene in fiecare proba biologica, raportat la unul din cele 8 gene PTP analizate. Rezultatele obtinute pana in prezent demonstreaza o expresie crescuta a genei uneia din genele celor 8 PTPaze analizate. Aceste rezultate reprezinta argumente ce sprijina ideea fundamentala a prezentului proiect conform careia profilele de expresie a unor PTP-uri difera in diferite etape de diferentiere a celulelor ombilicale sangvine in celule endoteliale.

Modul de diseminare a rezultatelor:

Alexandrina Burlacu. Tracking the stem cell fate after transplantation into the infarcted myocardium, manuscris trimis spre publicate la Current Stem Cell Research, noiembrie 2012.

Gabriela Grigorescu, Eugen Radu, Maya Simionescu, Alexandrina Burlacu. Behaviour and angiogenic properties of human endothelial progenitor cells under hypoxic conditions, manuscris in preparare, 2012.

Georgiana Petrareanu si Stefan Szedlacsek cu prezentarea orala, “Analysis of structure – function relationship in non-receptor PTPases” la Conferinta Internationala Anuala a Societatii Romane de Biochimie si Biologie Moleculara si Conferinta Anuala Internationala a Programului Postdoctoral “Biotehnologii celulare si moleculare pentru aplicatii medicale”, 13-14 septembrie 2012, Bucuresti, Romania.

Raportul fazei II (Sinteza II)

(15 noiembrie 2012-30 noiembrie 2013)

Unul din obiectivele majore ale proiectului a fost acela de a stabili un model preclinic de transplant celular uman. Din ratiuni etice, setarea parametrilor fizici de interactie intre celulele progenitoare si tesutul cardiac ischemic a fost realizata pe probe de tesut cardiac murin, care a determinat si o posibilitate mai buna de variere a conditiilor experimentale si o reproductibilitate mai buna. Aceste studii au dus la stabilirea parametrilor de co-cultivare a CEP cu tesutul cardiac adult, care permit integrarea celulelor in profunzimea tesutului.

Dupa optimizarea parametrilor fizici, modelul de cocultivare a celulelor endoteliale progenitoare (CEP) cu sectiuni de tesut cardiac adult a fost validat pe tesut uman. S-au utilizat probe de tesut atrial uman. Rezultatele au fost inglobate intr-o aplicatie intitulata: „Procedeu ex vivo de grefare a celulelor stem in sectiuni viabile de tesut cardiac uman”, care a fost depusa pentru brevetare.

Un alt obiectiv in cadrul proiectului este identificarea perechilor PTP-miR cu impact asupra angiogenezei. Desi contributia in angioneza a fost evidentiata, separat, atat pentru clasa de microARN cat si pentru PTP, corelatia functionala a celor doua categorii moleculare nu a fost inca realizata, nici practic si nici experimental. In aceasta faza au fost stabilite PTP-azele cu cele mai mari probabilitati de a fi reglate prin microARN in celulele endoteliale.

Modul de diseminare a rezultatelor:

„Procedeu ex vivo de grefare a celulelor stem in sectiuni viabile de tesut cardiac uman”, aplicatie de brevet la OSIM, nr inregistrare A/00845 din 14.11.2013

Burlacu A. Tracking the stem cell fate after transplantation into the infarcted myocardium. Curr Stem Cell Res Ther. 2013 Jul;8(4):284-91.

Grigorescu G, Liehn E. Dual capacity of early endothelial progenitor cells to secrete and express SDF-1 on their surface: a possible mechanism for neovascularization. Annals of RSCB, 2013 June; XVIII(1):32-43.

Grigorescu G, Preda M.B., Radu E., Rosca A.-M., Mitroi D., Burlacu A., Simionescu M. Molecular pathways involved in endothelial progenitor cell-induced neovascularization. prezentare orala la Cogresul International al Societatii Romane pentru Biologie Celulara, Timisoara, 5-9 iunie 2013.

Petrareanu G.The molecular and cellular characterization of a non-receptor protein tyrosine phosphatase, Rom. J. Biochem., 50 (1), 2013, 65-72.

Raportul fazei III (Sinteza III)

(1 decembrie 2013-30 noiembrie 2014)

In etapa III au fost finalizate activitatile de evaluare/caracterizare a coculturilor, corelarea gradului de participare la procesele de angiogeneza/ vasculogeneza cu etapele de diferentiere ale celulelor endoteliale progenitoare si profilul PTPurilor si selectarea miRs potential implicate in reglarea expresiei PTPurilor identificate.

Modul de diseminare a rezultatelor:

Preda MB, Rønningen T, Burlacu A, Simionescu M, Moskaug JO, Valen G. Remote transplantation of mesenchymal stem cells protects the heart against ischemia-reperfusion injury. Stem Cells. 2014 Aug; 32(8): 2123-34 (IF 7.7).

Rosca A.M., Tutuianu R. Emerging role of progenitor cell-derived exosomes as valuable tools for cardiovascular therapy, manuscris trimis spre publicare la Current Stem Cell Research and Therapy, 26 noiembrie 2014.

Badea R, Petrareanu G., Szedlacsek S. Assessement of the expression of PTPs potentially involved in endothelial progenitor cells diferentiation and angiogenesis”, poster prezentat la Conferinta Internationala a Societatii Romane de Biochimie si Biologie Moleculara (SRBBM) de la Baile Felix, din 4-6 iunie 2014. Abstractul acestui poster a fost publicat in revista Romanian Journal of Biochemistry, vol. 51, pag 46, la Editura Academiei Romane.

Raportul fazei IV (Sinteza)

(1 decembrie 2014-30 noiembrie 2015)

In etapa IV a fost finalizata activitatea de validare a perechilor PTP-miR prin tehnici de reducere/blocare si crestere a expresiei in timpul functiei angiogenice/vasculogenice a celulelor endoteliale progenitoare. De asemenea, au fost facute progrese in activitatea de corelare a profilului miR in cursul diferentierii celulelor endoteliale progenitoare cu potentialul lor angiogenic/vasculogenic si in activitatea de validare a perechilor PTP-miR vasculogenice prin metode de inducere a scaderii/blocarii expresiei pe modelul in vitro de transplat celular.

Modul de diseminare a rezultatelor:

Grigorescu G*, Preda MB*, Radu E, Rosca AM, Tutuianu R, Mitroi DN, Simionescu M, Burlacu A. Combinatorial approach for improving the outcome of angiogenic therapy in ischemic tissues. Biomaterials 2015; 60:72-81.

Preda MB, Rosca AM, Tutuianu R, Burlacu A. Pre-stimulation with FGF-2 increases in vitro functional coupling of mesenchymal stem cells with cardiac cells. Biochem Biophys Res Commun. 2015; 464(2): 667-73.

Rosca AM, Rayia DM, Tutuianu R. Emerging role of stem cells - derived exosomes as valuable tools for cardiovascular therapy. Curr Stem Cell Res Ther. 2015 Oct 26. [Epub ahead of print].

Mihaela Mentel, Rodica A. Badea, Georgiana Petrareanu, Sujay T. Mallikarjuna, Aura E. Ionescu, Stefan E. Szedlacsek, Expression, purification and kinetic analysis of PTP domains, capitol de carte acceptat pentru publicare in Methods in Molecular Biology, editura Springer, (2016).

Rosca A.-M., Burlacu A. Changes in microRNA expression induced by three-dimensional aggregation of mesenchymal stem cells. Annals Rom Soc Cell Biol. 2015, in press.

R. Badea, G. Petrareanu, A.M. Rosca, S. Szedlacsek. Modulation of the expression of protein tyrosine phosphatases involved in endothelial progenitor cells differentiation, poster prezentat la Conferinta Aniversara de 25 ani de la infiintarea SRBBM, 17-18 septembrie 2015, Bucuresti, Romania.

Preda MB, Simionescu M, Rosca A-M, Tutuianu R, Burlacu A. Short-lived host angiogenesis triggered at the site of transplantation sustains graft survival by reducing local hypoxia in mesenchymal stem cell aggregates. Prezentare orala la 1st ISRMS Congress, Bucharest, Romania, 12-16 Mai 2015.

Preda MB, Tutuianu R, Rosca A-M, Simionescu M, Burlacu A. Live imaging of carbonic anhydrase IX for in vivo and in vitro assessment of hypoxia in mesenchymal stem cell spheroids. Lucrare prezentata ca poster la The 7th National Congress with international participation and 33rd Annual scientific session of Romanian Society for Cell Biology”, Baia Mare, Romania, 10-14 iunie 2015.

Preda MB, Rosca A-M, Tutuianu R, Burlacu A. Differential expression pattern of connexin 43 in mesenchymal stem cells stimulated with growth factors. Prezentare orala la The 7th National Congress with international participation and 33rd Annual scientific session of Romanian Society for Cell Biology”, Baia Mare, Romania, 10-14 iunie 2015.

Burlacu A. Combinatorial strategies of ischemic heart engineering with mutual benefits for graft survival and host tissue regeneration. Prezentare orala la The 7th National Congress with international participation and 33rd Annual scientific session of Romanian Society for Cell Biology”, Baia Mare, Romania, 10-14 iunie 2015.

Rosca A.-M. Changes in microRNA expression induced by three-dimensional aggregation of mesenchymal. Prezentare orala la The 7th National Congress with international participation and 33rd Annual scientific session of Romanian Society for Cell Biology”, Baia Mare, Romania, 10-14 iunie 2015.

Raportul fazei V (Sinteza)

(1 decembrie 2015-30 noiembrie 2016)

In aceasta etapa a proiectului au fost definitivate activitatile propuse in planul de realizare. Rezultatele obtinute au aratat faptul perechea VEPTP - mi-377 are o contributie in procesul de angiogeneza si au confirmat, pe de o parte, efectul pro-angiogen al miR-377 in celulele endoteliale progenitoare si, pe de alta parte, possibilitatea de a creste efectele terapeutice ale acestor celule pe calea miR-377-VEPTP.

Modul de diseminare a rezultatelor:

Odent G*, Rosca A-M*, Preda MB, Simionescu M, Burlacu A. VEGF-A and SDF-1 as analogous acting factors responsible for the angiogenic paracrine properties of endothelial progenitor cells in normal and hypoxic conditions, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, in press, december 2016 (accepted on May 17, 2016).
A. Burlacu, M.B. Preda, G.Odent, E.Radu, A.-M.Rosca, R. Tutuianu,D.N. Mitroi, M.Simionescu. Combinatorial approach for improving the outcome of angiogenic therapy in ischemic tissues, poster prezentat la Congresul „The molecular and cellular basis of regeneration and tissue repair”, Salerno, Italia, 16 - 22 septembrie 2016.
A.M. Rosca, G. Odent, M.B. Preda, R. Tutuianu, M. Simionescu, A. Burlacu. Synergic effects of VEGF-A and SDF-1 on the angiogenic properties of endothelial progenitor cells, poster prezentat la Congresul „The molecular and cellular basis of regeneration and tissue repair”, Salerno, Italia, 16 - 22 septembrie 2016.
R. Tutuianu, M. Popescu, M.B. Preda, A.M. Rosca, M. Simionescu, R. Piticescu, A. Burlacu. PEI-coated Fe3O4 nanoparticles increase the efficiency of intracellular delivery of biologically active factors incorporated either during or after synthesis, poster prezentat la Congresul „The molecular and cellular basis of regeneration and tissue repair”, Salerno, Italia, 16 - 22 septembrie 2016.
Burlacu A. Cytoprotective, angiogenic and immunomodulatory contributions of mesenchymal stem cells in ischemic tissue regeneration”, prezentare orala la Conferinta „8^th National Congress with International Participation and 34^th Annual Scientific Session of Romanian Society of Cellular Biology”, 7-13 iuie 2016, Oradea.
Preda MB, Tutuianu R, Burlacu A. Setting up optimal conditions for remote transplantation of mesenchymal stem cells: smaller transplantation doses produce benefits with fewer side effects”, poster prezentat la Conferinta „8^th National Congress with International Participation and 34^th Annual Scientific Session of Romanian Society of Cellular Biology”, 7-13 iuie 2016, Oradea.
Odent G*, Rosca A-M*, Preda MB, Simionescu M, Burlacu A. Synergic effects of VEGF-A and SDF-1 on the angiogenic properties of endothelial progenitor cells, prezentare orala la Conferinta „8^th National Congress with International Participation and 34^th Annual Scientific Session of Romanian Society of Cellular Biology”, 7-13 iuie 2016, Oradea.
Tutuianu R, Popescu M, Preda MB, Rosca AM, Simionescu M, Piticescu R, Burlacu A. PEI-coated Fe3O4 nanoparticles increase the efficiency of intracellular delivery of biologically active factors incorporated either during or after synthesis, prezentare orala la Conferinta „8^th National Congress with International Participation and 34^th Annual Scientific Session of Romanian Society of Cellular Biology”, 7-13 iuie 2016, Oradea.

CONCEPT

PREZENTARE

FAZA I

FAZA II

FAZA III

FAZA IV

DISEMINARE

Preclinical model of cell therapy employing protein tyrosine phosphatase-microRNA interplay to optimize neovascularization (“THERION”). Partnership project.

Funding source: Romanian Ministry of Education and Research Framework Program PNCDI-II.