Networking & Grants  »  Grants  »  National Grants
OXIGENEDIT

 

 

 

 

RO

GRANT acordat de Autoritatea Națională pentru Cercetare Științifică și Inovare, CNCS-UEFISCDI

PROGRAMUL P4: Cercetare fundamentală și de frontieră

TIP PROIECT Proiecte de cercetare exploratorie (PCE)

 

COD PROIECT PN-III-P4-PCE-2021-0831

CONTRACT PCE-90/2022

TITLU PROIECT

Stimularea enzimelor antioxidante endogene prin editare genica cu CRISPR/Cas9, o abordare inovatoare pentru terapie complementara in bolile metabolice

 

ACRONIM OXIGENEDIT

PERIOADA 02.iun.2022 – 31.dec.2024 (31 luni)

BUGET 1.200.000 LEI

COORDONATOR Institutul de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu“ (IBPC-NS)

DIRECTOR DE PROIECT: Dr. Camelia S. STANCU

ECHIPA DE CERCETARE :

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Drd. Teodora Barbălată, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo

 

REZUMAT

Echilibrul dintre moleculele pro-oxidante și cele antioxidante este necesar pentru buna funcționare a celulelor. Perturbarea acestui echilibru duce la diminuarea protecției antioxidante și generarea stresului oxidativ și a celui inflamator care constituie factori de risc decisivi în numeroase patologii, inclusiv în bolile metabolice cu impact socio-economic major. Deoarece la oameni antioxidanții exogeni nu s-au dovedit a fi eficienți împotriva stresului oxidativ, propunem pentru a fi investigată în acest proiect supra-exprimarea enzimelor antioxidante endogene. Scopul acestui proiect este optimizarea procedurii de editare genică pentru a supra-exprima enzime antioxidante endogene in vitro și in vivo. Originalitatea proiectului constă în supra-exprimarea enzimelor paraoxonaza 1/2 și glutation-peroxidaze în celule care controlează metabolismul (enterocite, hepatocite) sau sistemul de apărare (monocite) pentru a combate efectele stresului oxidativ și ale celui inflamator. Abordarea inovatoare a proiectului rezidă în utilizarea tehnologiei CRISPR/(d)Cas9 in vitro și combinarea acesteia cu sisteme specifice de livrare a plasmidelor in vivo, către țesuturi-țintă pentru a supra-exprima enzime antioxidante care să reducă stresului oxidativ și pe cel inflamator. Proiectul abordează un procedeu terapeutic neexplorat ale cărui rezultate vor contribui la dezvoltarea de terapii genice organ-specifice inovatoare pentru un control mai bun al stresului oxidativ și al celui inflamator în diferite boli, cu impact socio-economic pozitiv.

 

              

ENG

GRANT awarded by the Romanian National Authority for Scientific Research and Innovation

PROGRAME P4: Fundamental and frontier research

PROJECT TYPE: Exploratory Research Projects

 

PROJECT CODE PN-III-P4-PCE-2021-0831

CONTRACT No. PCE-90/2022

PROJECT TITLE 

Boosting endogenous anti-oxidant enzymes by CRISPR/Cas9-based gene editing, an innovative approach for complementary therapy in metabolic disorders

 

ACRONYM OXIGENEDIT

PERIOD 02.Jun.2022 – 31.Dec.2024 (31 months)

BUDGET 1.200.000 RON

COORDINATOR Institute of Cellular Biology and Pathology „Nicolae Simionescu“ (ICBP-NS)

PROJECT LEADER Dr. Camelia S. STANCU

RESEARCH TEAM 

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Drd. Teodora Barbălată, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo

 

ABSTRACT

The balance between pro- and anti-oxidant molecules is required for proper function of the cells. Disturbance of this balance leads to diminution of the antioxidant defense and generation of oxidative stress, that further triggers inflammatory stress, which are critical risk factors for various diseases, including metabolic disorders representing a major socio-economic burden. Since exogenous antioxidants failed to prove efficient against oxidative stress in humans, we propose the overexpression of endogenous antioxidant enzymes as an original option to be investigated. The aim of this project is to optimize the gene editing procedure to overexpress endogenous antioxidants in vitro and in vivo. The originality of this proposal lies in the overexpression of endogenous antioxidant enzymes paraoxonase 1/2 and glutathione peroxidases in cells controlling metabolism (enterocytes, hepatocytes), or the defense system (monocytes) to combat oxidative and inflammatory stress. The innovative approach of the project consists in using CRISPR/(d)Cas9 technology to overexpress the endogenous antioxidant enzymes in vitro, or combined with in vivo-delivery systems for tissue-specific targets to counteract the harmful effects of OxS and InflamS in vivo. The project addresses an unexplored therapeutic approach and the results will help to develop innovative organ-specific gene therapies for a better management of oxidative and inflammatory stress, with valuable socio-economic impact.

 

 

 

Etapa 1 - 2022 

  • Creşterea capacității anti-oxidante a enterocitelor prin supraexprimarea glutation-peroxidazei 2 (GPx2), glutation-reductazei (GR) sau paraoxonazei 2 (PON2) endogene; evaluarea efectelor protectoare asupra celulelor endoteliale (CE) activate pro-inflamator

 

Rezumat

Echilibrul dintre moleculele pro-oxidante şi cele antioxidante este necesar pentru buna funcționare a tuturor celulelor. Perturbarea acestui echilibru duce la diminuarea protecției antioxidante şi generarea stresului oxidativ şi a celui inflamator, care constituie factori de risc decisivi în numeroase patologii, inclusiv în bolile metabolice care au un impact socio-economic major. Deoarece administrarea de antioxidanți exogeni nu s-a dovedit a fi eficientă împotriva stresului oxidativ crescut la oameni, ne-am propus să investigăm în acest proiect supra-exprimarea unor enzime antioxidante endogene. Scopul acestui proiect este de a optimiza procedura de editare genică pentru a supra-exprima enzimele antioxidante endogene paraoxonaza 1/2 (PON1/2), glutation-peroxidaza (GPx) şi glutation-reductaza (GR) în celule care controlează metabolismul, precum enterocitele şi hepatocitele, pentru a combate efectele stresului oxidativ şi ale celui inflamator, in vitro şi in vivo. Pentru atingerea acestui scop, în această primă etapă a proiectului am testat diferite condiții experimentale pentru a optimiza supra-exprimarea enzimelor PON2, GPx2 şi GR în celule enterocite. Am obținut supra-exprimarea enzimelor GPx2, GR şi PON2 şi am stabilit condițiile optime pentru această etapă. Am pus la punct metoda de determinare a nivelurilor de glutation redus (GSH) şi glutation oxidat (GSSG) în celule enterocite şi am cuantificat expresia genică a unor proteine pro-oxidante în celule enterocite transfectate. Am evaluat apoi efectul protector al mediului condiționat provenit de la celule enterocite care supraexprimă GPx2 asupra celulelor endoteliale activate cu factorul de necroză tumorală α (TNFα). Toate activitățile prevăzute pentru această etapă a proiectului au fost realizate.

 

Sumar al progresului – Concluzii 

  • Am stabilit condițiile optime pentru supra-exprimarea GPx2, GR şi PON2 în celule enterocite;
  • Am optimizat metoda de determinare a nivelurilor de GSH şi GSSG în celule enterocite;
  • Supra-exprimarea enzimei GPx2 în celule enterocite a indus scăderea expresiei genice a unor proteine implicate în activitatea complexului pro-oxidant NADPHox;
  • Supra-exprimarea enzimelor GPx2 şi GR în celule enterocite a potențat mediul condiționat al acestor celule cu proprietăți anti-inflamatorii capabile să atenueze secreția de VCAM-1 şi MCP-1 de către celule endoteliale activate cu TNFα.

 

Etapa 2 - 2023 

  • Generarea de hepatocite umane care supra-exprimă PON1/2/GPx1/4/GR endogene; evaluarea efectului lor protectiv în celule endoteliale activate pro-inflamator
  • Optimizarea procedurii de editare genică pentru obținerea de monocite care supra-exprimă PON1/2/GPx1/4/GR endogene - evaluarea adeziunii lor la celule endoteliale activate

 

Rezumat

Unul dintre factorii care asigură buna funcționare a celulelor organismului este echilibrul dintre moleculele pro-oxidante şi cele antioxidante. În acest proiect ne-am propus să investigăm noi metode pentru supra-exprimarea unor enzime antioxidante endogene cu scop terapeutic, pentru patologii în care se asociază un stres oxidativ şi unul inflamator crescut. Scopul acestei etape a proiectului a fost de a optimiza procedura de editare genică pentru a supra-exprima enzimele antioxidante endogene paraoxonaza 1/2 (PON1/2), glutation-peroxidaza (GPx1/4) şi glutation-reductaza (GR) în celule care controlează metabolismul, precum hepatocitele, şi în celule componente ale sistemului imun, precum monocite-macrofage. Pentru atingerea acestui scop, am testat diferite condiţii experimentale pentru a optimiza supra-exprimarea enzimelor PON2, GPx2 şi GR în celule hepatocite din linia Huh7 şi monocite din linia THP-1. Rezultate: am obținut supra-exprimarea enzimelor GPx1, GR şi PON1/2 în hepatocitele transfectate şi am evidențiat efectul protector al mediului condiționat de la celulele transfectate asupra celulelor endoteliale activate pro-inflamator cu factorul de necroză tumorală α. Supra-exprimarea enzimelor antioxidante țintă în monocite nu s-a putut realiza, deși au fost testate mai multe condiții experimentale care au inclus densitatea celulară, concentrația de plasmide şi reactiv de transfecție, precum şi pre-activarea celulelor cu forbol miristat acetat. Am realizat diferențierea monocitelor în macrofage pro-inflamatorii (M1) sau anti-inflamatorii (M2). Rezultatele obținute în această etapă au fost prezentate la o conferință internațională şi o parte din date au fost publicate într-o lucrare apărută în revistă indexată ISI (Web of Science Core Collection).

 

Sumar al progresului – Concluzii 

  • Am stabilit condițiile optime pentru supra-exprimarea GPx1, GR/PON2 şi PON1 în celule hepatocite în cultură;
  • Am obținut stimularea secreţiei de PON-1 în mediul de cultură al hepatocitelor transfectate sӑ supra-exprime această proteină;
  • Am optimizat metoda de determinare a nivelurilor de GSH şi GSSG în hepatocitele umane şi am demonstrat funcționalitatea GPx1 prin capacitatea acesteia de a creşte nivelul GSSG;
  • Supra-exprimarea enzimelor antioxidante PON1/PON2/GPx1/GR a redus stresul oxidativ mitocondrial în hepatocitele aflate atât în condiții normale, cât şi pro-inflamatorii (stimulate cu TNFα);
  • Supra-exprimarea PON2 în hepatocitele umane a potențat mediul condiționat al acestor celule cu proprietăți anti-inflamatorii şi anti-oxidante capabile să reducă expresia MCP-1, VCAM-1 şi p22phox în celule endoteliale activate cu TNFα;
  • Supraexprimarea GPx-1 în hepatocitele umane a indus mediului condiționat proprietăți anti-inflamatorii capabile sӑ reducă expresia proteica a VCAM-1 în celulele endoteliale activate cu TNFα;
  • Transfectarea monocitelor THP-1 şi a monocitelor pre-activate cu PMA nu a fost posibilă;
  • Diferențierea monocitelor THP-1 in macrofage tip M1 si M2 a fost realizata cu succes.

 

Diseminare

  • Am publicat o lucrare într-o revistă indexată ISI (2022 IF 5,4, Q1): 

Deleanu M., Toma L., Sanda G.M., Barbălată T., Niculescu L.S., Sima A.V., Deleanu C., Săcărescu L., Suciu A., Alexandru G., Crişan I., Popescu M., Stancu C.S. Formulation of Phytosomes with Extracts of Ginger Rhizomes and Rosehips with Improved Bioavailability, Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects In Vivo. Special Issue: The Study of Plant Compounds in Antioxidant Activity and Anticancer Activity. Pharmaceutics. 15(4):1066, 2023; doi: 10.3390/pharmaceutics15041066 (2022 IF 5,4, Q1).

 

  • Am participat la Conferința Internațională 40th Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB) cu o comunicare cu Poster: 

Gabriela M. Sanda, Laura Toma, Elena V. Fuior, Jessica Ciobanu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. CRISPR/dCa9 gene Editing to Overexpress Glutathione Peroxidase in Human Enterocytes, an Advanced Method to Increase the Endogenous Antioxidant Potential. Bulletin of RSCB, volume 48, November 2023.

 

Etapa 3 - 2024 

  • Generarea și caracterizarea unui model de șoarece care supraexprimă enzimele endogene PON1/2 / GPx1/2 pentru ameliorarea stresului oxidativ și inflamator sistemic

 

Rezumat

Scopul acestei etape a proiectului a fost de a optimiza procedura de editare genică pentru a supra-exprima enzimele antioxidante endogene paraoxonaza 1/2 (PON1/2) și glutation-peroxidaza 1/2 (GPx1/2) in vivo, pentru a combate efectele stresului oxidativ și ale celui inflamator asociate bolilor metabolice. Pentru atingerea acestui scop, am utilizat un model de șoarece deficient în apolipoproteina E (apoE-/-) și hrănit cu dietă grasă pentru a dezvolta hiperlipidemie și hepatosteatoză,  patologii care fac parte din clasa bolilor metabolice.

Rezultate: am reușit să creștem potențialul antioxidant în sânge și ficatul șoarecilor tratați cu plasmidele de activare a enzimelor PON1/2 și GPx1/2 în paralel cu reducerea stresului inflamator. Am publicat două articole în reviste indexate ISI, am participat la conferințe naționale/internaționale cu trei comunicări și am efectuat două stagii de pregătire. Toate obiectivele și activitățile proiectului au fost realizate, iar indicatorii de rezultat au fost îndepliniți.

 

Sumar al progresului – Concluzii 

  • Am realizat un preparat optimizat de plasmide CRISPR/dCas9 pentru activarea genelor țintă și l-am administrat la șoareci apoE-/- hrăniți cu dietă grasă, fără a induce efecte adverse incompatibile cu viața;
  • Am reușit să inducem creșterea nivelului de GSH și activitatea enzimei antioxidante PON1/2 în circulație;
  • Am obținut diminuarea aspectului steatotic al ficatului șoarecilorapo E-/- hrăniți cu dietă grasă timp de patru săptămâni în urma administrării plasmidelor pentru activarea GPx1/2 și PON1/2;
  • Am obținut o creștere a nivelului de GSH în ficatul șoarecilor tratați cu plasmide pentru activarea GPx1 și PON2;
  • Am obținut o reducere a expresiei proteice a factorului pro-inflamator Il1β în ficatul șoarecilor tratați cu plasmide pentru activarea GPx1/2 și PON2.

 

Diseminare

Participarea la conferințe naționale/internaționale

  1. Gabriela M. Sanda, Laura Toma, Elena V. Fuior, Jessica I.C. Ciobanu, Loredan S. Niculescu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. The secretome of human enterocytes over-expressing endogenous gluthathione peroxidases by CRISPR/dCas9 system improves endothelial cell dysfunction. International Vascular Biology Meeting 2024, Amsterdam, Netherlands, 02 – 05.07.2024.
  2. Jessica I.C. Ciobanu, Laura Toma, Elena V. Fuior, Gabriela M. Sanda, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. CRISPR/dCas9 long-term transcriptional activation of hepatic key proteins to improve HDL function.  Comunicare orala sesiunea doctoranzilor la Conferința Internațională 41st Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB), December 11-13, 2024, Târgu Mureș, Romania
  3. Teodora Barbălată, Orina Moraru, Gabriela M. Sanda, Laura Toma, Camelia S. Stancu, Anca V. Sima, Loredan S. Niculescu. Non-coding RNAs as novel biomarkers in atherosclerosis, Comunicare poster la Conferința Internațională 41st Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB), December 11-13, 2024, Târgu Mureș, Romania

 

Lucrări publicate

  1. Dimitris Kardassis, Cécile Vindis, Camelia S. Stancu, Laura Toma, Anca V. Gafencu, Adriana Georgescu, Nicoleta Alexandru-Moise, Filippo Molica, Brenda R. Kwak, Alexandrina Burlacu, Ignacio Fernando Hall, Elena Butoi, Paolo Magni, Junxi Wu, Susana Novella, Luke F. Gamon, Michael J. Davies, Andrea Caporali, Fernando de la Cuesta, Tijana Mitić - EU-AtheroNET COST Action CA21153. Unravelling molecular mechanisms in atherosclerosis using cellular models and omics technologies. Vascular Pharmacology, in press, 2024.
  2. Laura Toma, Mariana Deleanu, Gabriela M. Sanda, Teodora Barbălată, Loredan S. Niculescu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. Bioactive Compounds Formulated in Phytosomes Administered as Complementary Therapy for Metabolic Disorders. International Journal of Molecular Sciences 2024; 25(8):4162. doi: 10.3390/ijms25084162.

 

Stagii de pregătire

  • Drd. Teodora Barbalata si drd. Jessica I. C. Ciobanu au efectuat stagiul de pregatire în lucru cu animale de laborator „10th FELASA International Course Care & Use of Laboratory Animals (CULA) for Mice, Rats and Zebrafish” (https://cula-uoc.eu/). Partea teoretică a stagiului s-a desfășurat on-line în perioada 17.04.2024 – 24.05.2024, iar partea practică s-a desfășurat în perioada 30.05.2024 – 08.06.2024 la Universitatea din Creta, Departamentul de Biologie, Heraklion, Grecia.