RO

GRANT acordat de Autoritatea Națională pentru Cercetare Științifică și Inovare, CNCS-UEFISCDI

PROGRAMUL P4: Cercetare fundamentală și de frontieră

TIP PROIECT Proiecte de cercetare exploratorie (PCE)

COD PROIECT PN-III-P4-PCE-2021-0831

CONTRACT PCE-90/2022

TITLU PROIECT

Stimularea enzimelor antioxidante endogene prin editare genica cu CRISPR/Cas9, o abordare inovatoare pentru terapie complementara in bolile metabolice

ACRONIM OXIGENEDIT

PERIOADA 02.iun.2022 – 31.dec.2024 (31 luni)

BUGET 1.200.000 LEI

COORDONATOR Institutul de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu“ (IBPC-NS)

DIRECTOR DE PROIECT: Dr. Camelia S. STANCU

ECHIPA DE CERCETARE :

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Drd. Teodora Barbălată, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo

REZUMAT

Echilibrul dintre moleculele pro-oxidante și cele antioxidante este necesar pentru buna funcționare a celulelor. Perturbarea acestui echilibru duce la diminuarea protecției antioxidante și generarea stresului oxidativ și a celui inflamator care constituie factori de risc decisivi în numeroase patologii, inclusiv în bolile metabolice cu impact socio-economic major. Deoarece la oameni antioxidanții exogeni nu s-au dovedit a fi eficienți împotriva stresului oxidativ, propunem pentru a fi investigată în acest proiect supra-exprimarea enzimelor antioxidante endogene. Scopul acestui proiect este optimizarea procedurii de editare genică pentru a supra-exprima enzime antioxidante endogene in vitro și in vivo. Originalitatea proiectului constă în supra-exprimarea enzimelor paraoxonaza 1/2 și glutation-peroxidaze în celule care controlează metabolismul (enterocite, hepatocite) sau sistemul de apărare (monocite) pentru a combate efectele stresului oxidativ și ale celui inflamator. Abordarea inovatoare a proiectului rezidă în utilizarea tehnologiei CRISPR/(d)Cas9 in vitro și combinarea acesteia cu sisteme specifice de livrare a plasmidelor in vivo, către țesuturi-țintă pentru a supra-exprima enzime antioxidante care să reducă stresului oxidativ și pe cel inflamator. Proiectul abordează un procedeu terapeutic neexplorat ale cărui rezultate vor contribui la dezvoltarea de terapii genice organ-specifice inovatoare pentru un control mai bun al stresului oxidativ și al celui inflamator în diferite boli, cu impact socio-economic pozitiv.

ENG

GRANT awarded by the Romanian National Authority for Scientific Research and Innovation

PROGRAME P4: Fundamental and frontier research

PROJECT TYPE: Exploratory Research Projects

PROJECT CODE PN-III-P4-PCE-2021-0831

CONTRACT No. PCE-90/2022

PROJECT TITLE

Boosting endogenous anti-oxidant enzymes by CRISPR/Cas9-based gene editing, an innovative approach for complementary therapy in metabolic disorders

ACRONYM OXIGENEDIT

PERIOD 02.Jun.2022 – 31.Dec.2024 (31 months)

BUDGET 1.200.000 RON

COORDINATOR Institute of Cellular Biology and Pathology „Nicolae Simionescu“ (ICBP-NS)

PROJECT LEADER Dr. Camelia S. STANCU

RESEARCH TEAM

Acad. Anca V. Sima, Dr. Loredan S. Niculescu, Dr. Gabriela M. Sanda, Dr. Laura Toma, Drd. Teodora Barbălată, Dr. Elena V. Fuior, Dr. Ioana M. Fenyo

ABSTRACT

The balance between pro- and anti-oxidant molecules is required for proper function of the cells. Disturbance of this balance leads to diminution of the antioxidant defense and generation of oxidative stress, that further triggers inflammatory stress, which are critical risk factors for various diseases, including metabolic disorders representing a major socio-economic burden. Since exogenous antioxidants failed to prove efficient against oxidative stress in humans, we propose the overexpression of endogenous antioxidant enzymes as an original option to be investigated. The aim of this project is to optimize the gene editing procedure to overexpress endogenous antioxidants in vitro and in vivo. The originality of this proposal lies in the overexpression of endogenous antioxidant enzymes paraoxonase 1/2 and glutathione peroxidases in cells controlling metabolism (enterocytes, hepatocytes), or the defense system (monocytes) to combat oxidative and inflammatory stress. The innovative approach of the project consists in using CRISPR/(d)Cas9 technology to overexpress the endogenous antioxidant enzymes in vitro, or combined with in vivo-delivery systems for tissue-specific targets to counteract the harmful effects of OxS and InflamS in vivo. The project addresses an unexplored therapeutic approach and the results will help to develop innovative organ-specific gene therapies for a better management of oxidative and inflammatory stress, with valuable socio-economic impact.

Etapa 1 - 2022

Creşterea capacității anti-oxidante a enterocitelor prin supraexprimarea glutation-peroxidazei 2 (GPx2), glutation-reductazei (GR) sau paraoxonazei 2 (PON2) endogene; evaluarea efectelor protectoare asupra celulelor endoteliale (CE) activate pro-inflamator.

Rezumat

Echilibrul dintre moleculele pro-oxidante şi cele antioxidante este necesar pentru buna funcționare a tuturor celulelor. Perturbarea acestui echilibru duce la diminuarea protecției antioxidante şi generarea stresului oxidativ şi a celui inflamator, care constituie factori de risc decisivi în numeroase patologii, inclusiv în bolile metabolice care au un impact socio-economic major. Deoarece administrarea de antioxidanți exogeni nu s-a dovedit a fi eficientă împotriva stresului oxidativ crescut la oameni, ne-am propus să investigăm în acest proiect supra-exprimarea unor enzime antioxidante endogene. Scopul acestui proiect este de a optimiza procedura de editare genică pentru a supra-exprima enzimele antioxidante endogene paraoxonaza 1/2 (PON1/2), glutation-peroxidaza (GPx) şi glutation-reductaza (GR) în celule care controlează metabolismul, precum enterocitele şi hepatocitele, pentru a combate efectele stresului oxidativ şi ale celui inflamator, in vitro şi in vivo. Pentru atingerea acestui scop, în această primă etapă a proiectului am testat diferite condiții experimentale pentru a optimiza supra-exprimarea enzimelor PON2, GPx2 şi GR în celule enterocite. Am obținut supra-exprimarea enzimelor GPx2, GR şi PON2 şi am stabilit condițiile optime pentru această etapă. Am pus la punct metoda de determinare a nivelurilor de glutation redus (GSH) şi glutation oxidat (GSSG) în celule enterocite şi am cuantificat expresia genică a unor proteine pro-oxidante în celule enterocite transfectate. Am evaluat apoi efectul protector al mediului condiționat provenit de la celule enterocite care supraexprimă GPx2 asupra celulelor endoteliale activate cu factorul de necroză tumorală α (TNFα). Toate activitățile prevăzute pentru această etapă a proiectului au fost realizate.

Sumar al progresului – Concluzii

Am stabilit condițiile optime pentru supra-exprimarea GPx2, GR şi PON2 în celule enterocite;
Am optimizat metoda de determinare a nivelurilor de GSH şi GSSG în celule enterocite;
Supra-exprimarea enzimei GPx2 în celule enterocite a indus scăderea expresiei genice a unor proteine implicate în activitatea complexului pro-oxidant NADPHox;
Supra-exprimarea enzimelor GPx2 şi GR în celule enterocite a potențat mediul condiționat al acestor celule cu proprietăți anti-inflamatorii capabile să atenueze secreția de VCAM-1 şi MCP-1 de către celule endoteliale activate cu TNFα.

Etapa 2 - 2023

Generarea de hepatocite umane care supra-exprimă PON1/2/GPx1/4/GR endogene; evaluarea efectului lor protectiv în celule endoteliale activate pro-inflamator.
Optimizarea procedurii de editare genică pentru obținerea de monocite care supra-exprimă PON1/2/GPx1/4/GR endogene - evaluarea adeziunii lor la celule endoteliale activate.

Rezumat

Unul dintre factorii care asigură buna funcționare a celulelor organismului este echilibrul dintre moleculele pro-oxidante şi cele antioxidante. În acest proiect ne-am propus să investigăm noi metode pentru supra-exprimarea unor enzime antioxidante endogene cu scop terapeutic, pentru patologii în care se asociază un stres oxidativ şi unul inflamator crescut. Scopul acestei etape a proiectului a fost de a optimiza procedura de editare genică pentru a supra-exprima enzimele antioxidante endogene paraoxonaza 1/2 (PON1/2), glutation-peroxidaza (GPx1/4) şi glutation-reductaza (GR) în celule care controlează metabolismul, precum hepatocitele, şi în celule componente ale sistemului imun, precum monocite-macrofage. Pentru atingerea acestui scop, am testat diferite condiţii experimentale pentru a optimiza supra-exprimarea enzimelor PON2, GPx2 şi GR în celule hepatocite din linia Huh7 şi monocite din linia THP-1. Rezultate: am obținut supra-exprimarea enzimelor GPx1, GR şi PON1/2 în hepatocitele transfectate şi am evidențiat efectul protector al mediului condiționat de la celulele transfectate asupra celulelor endoteliale activate pro-inflamator cu factorul de necroză tumorală α. Supra-exprimarea enzimelor antioxidante țintă în monocite nu s-a putut realiza, deși au fost testate mai multe condiții experimentale care au inclus densitatea celulară, concentrația de plasmide şi reactiv de transfecție, precum şi pre-activarea celulelor cu forbol miristat acetat. Am realizat diferențierea monocitelor în macrofage pro-inflamatorii (M1) sau anti-inflamatorii (M2). Rezultatele obținute în această etapă au fost prezentate la o conferință internațională şi o parte din date au fost publicate într-o lucrare apărută în revistă indexată ISI (Web of Science Core Collection).

Sumar al progresului – Concluzii

Am stabilit condițiile optime pentru supra-exprimarea GPx1, GR/PON2 şi PON1 în celule hepatocite în cultură;
Am obținut stimularea secreţiei de PON-1 în mediul de cultură al hepatocitelor transfectate sӑ supra-exprime această proteină;
Am optimizat metoda de determinare a nivelurilor de GSH şi GSSG în hepatocitele umane şi am demonstrat funcționalitatea GPx1 prin capacitatea acesteia de a creşte nivelul GSSG;
Supra-exprimarea enzimelor antioxidante PON1/PON2/GPx1/GR a redus stresul oxidativ mitocondrial în hepatocitele aflate atât în condiții normale, cât şi pro-inflamatorii (stimulate cu TNFα);
Supra-exprimarea PON2 în hepatocitele umane a potențat mediul condiționat al acestor celule cu proprietăți anti-inflamatorii şi anti-oxidante capabile să reducă expresia MCP-1, VCAM-1 şi p22phox în celule endoteliale activate cu TNFα;
Supraexprimarea GPx-1 în hepatocitele umane a indus mediului condiționat proprietăți anti-inflamatorii capabile sӑ reducă expresia proteica a VCAM-1 în celulele endoteliale activate cu TNFα;
Transfectarea monocitelor THP-1 şi a monocitelor pre-activate cu PMA nu a fost posibilă;
Diferențierea monocitelor THP-1 in macrofage tip M1 si M2 a fost realizata cu succes.

Diseminare

Am publicat o lucrare într-o revistă indexată ISI (2022 IF 5,4, Q1):

Deleanu M., Toma L., Sanda G.M., Barbălată T., Niculescu L.S., Sima A.V., Deleanu C., Săcărescu L., Suciu A., Alexandru G., Crişan I., Popescu M., Stancu C.S. Formulation of Phytosomes with Extracts of Ginger Rhizomes and Rosehips with Improved Bioavailability, Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects In Vivo. Special Issue: The Study of Plant Compounds in Antioxidant Activity and Anticancer Activity. Pharmaceutics. 15(4):1066, 2023; doi: 10.3390/pharmaceutics15041066 (2022 IF 5,4, Q1).

Am participat la Conferința Internațională 40^th Annual Scientific Session of the Romanian Society for Cell Biology (RSCB) cu o comunicare cu Poster:

Gabriela M. Sanda, Laura Toma, Elena V. Fuior, Jessica Ciobanu, Anca V. Sima, Camelia S. Stancu. CRISPR/dCa9 gene Editing to Overexpress Glutathione Peroxidase in Human Enterocytes, an Advanced Method to Increase the Endogenous Antioxidant Potential. Bulletin of RSCB, volume 48, November 2023.