National Grants
Proiect : PN-III-P4-PCE-2021-1755
A novel anti-atherosclerotic chimeric protein for prevention the inflammatory cells infiltration in the atheromatous plaque
O nouă proteină himerică anti-aterosclerotică pentru prevenirea infiltrării celulelor inflamatorii în placa ateromatoasă
Acronim: FasTrap
Contract 124/2022
Director proiect : Dr. Anca Violeta Gafencu
Finantare: 1.200.000 lei
Rezumat
Bolile cardiovasculare sunt principalele cauze de mortalitate. Ateroscleroza este o boală a arterelor, caracterizată prin formarea plăcii ateromatoase care limitează fluxul sanguin. Aspectul inflamator al aterosclerozei include activarea endoteliului care începe să exprime molecule de adeziune precum VCAM-1 și infiltrarea celulelor imune în peretele vaselor de sange. Ne propunem să inducem moartea celulelor imune care se infiltrează în placa aterosclerotică prin livrarea lentivirală, selectivă si locală a unei gene terapeutice care codifică o proteină himerică formată din două părți principale: (i) peptida de legare VCAM-1 (VBP) pentru ancorare și (ii) FasL solubil, ca declanșator apoptotic. VBP asigură agregarea și oligomerizarea FasL la suprafața endoteliului activat permițând interacțiunea cu receptorul Fas exprimat pe celulele inflamatorii care se infiltrează în placa ateromatoasă. Această interacțiune va induce apoptoza celulelor imune infiltrante, va reduce formarea celulei de spumoase în placă și va opri progresia aterosclerozei (Figura 1).Dezvoltarea acestei strategii prin prezentul proiect va deschide noi orizonturi și oportunități pentru tratamentul bolilor inflamatorii. Ne așteptăm ca noua noastră terapie să aibă o eficacitate ridicată și, cel mai important, efecte secundare mai puțin severe datorită direcționării selective. Tratamentul nostru conoferă un beneficiu social și economic clar datorită cresterii duratei si calității vieții.
Abstract
Cardiovascular diseases are the leading causes of mortality. Atherosclerosis is a disease of the arteries, characterized by the formation of the atheromatous plaque that limits blood flow. The inflammatory aspect of atherosclerosis includes the activation of the endothelium which begins to express adhesion molecules such as VCAM-1 and the infiltration of the immune cells in the vessel wall. Here we aim to induce the death of the immune cells infiltrating in the atherosclerotic plaque by the local and selective lentiviral delivery of a therapeutic gene encoding a chimeric protein consisting of two main parts: VCAM-1 binding peptide (VBP) for anchoring and soluble FasL, as an apoptotic trigger. VBP will ensure the clustering and oligomerization of FasL at the surface of the activated endothelium allowing the interaction with the Fas receptor expressed on the inflammatory cells infiltrating in the atheromatous plaque. This interaction will induce apoptosis of the infiltrating immune cells, will reduce the foam-cell formation in the plaque, and will arrest the progression of atherosclerosis (Fig 1). The development of this strategy by the present project will open new horizons and opportunities for the treatment of inflammatory diseases. We expect our novel therapy to show high efficacy, and most importantly, less severe side effects due to selective targeting. Our targeted treatment would provide a clear social and economic benefit due to increased survival and better quality of life.
Figura 1. Ipoteza proiectului. Molecula himerica VBP-FasL asigură agregarea și oligomerizarea FasL la suprafața endoteliului activat permițând interacțiunea cu receptorul Fas exprimat pe celulele inflamatorii care se infiltrează în placa ateromatoasă. Această interacțiune va induce apoptoza celulelor imune infiltrante, va reduce formarea celulei de spumoase în placă și va opri progresia aterosclerozei.
Rezultate obtinute:
In prima etapa, prin clonare moleculara, s-au obtinut urmatoarele plasmide (Figura 2):
1.pCDH-CMV-VBP-sFasL;
2. pCDH-VCAM-sFasL;
Figura 2. Plasmidele utilizate pentru testarea capacitatii moleculei himerice: pCDH-CMV-VBP-sFasL si pCDH-VCAM-sFasL
Lentivirusurile cu vectorii de expresie pCDH-CMV-VBP-sFasL si pCDH-VCAM-sFasL au fost impachetate. Pe baza moleculei reporter GFP, virusurile impachetate au fost titrate prin citometrie in flux (Fig.3)
Figura 3 Titrarea prin citometrie de flux. In functie de cantitatea de virus necesara pentru inducerea GFP intr-un procent de 5-20% din celulele initial insamantate, se stabileste titrul viral in unitati de transductie per mililitru.
In functie de titrul virusului, celulele transduse exprima in mod diferentiat proteina de interes, cat si proteina reporter -GFP (Figura 4).
Figura 4. Celule transduse cu virusuri cu titru diferit. In figura din dreapta titrul este de 10 ori mai mic.
Au fost obtinute rezultate despre potentialul moleculei himere de a se lega de suprafata celulelor endoteliale activate, prin intermediul VCAM1 si de a induce apoptoza in celulele care prezinta receptorul Fas. Pentru aceasta au fost obtinute clone de celule care secreta in mediu de cultura himera de interes (Figura 5).
Fig 5. Clone de celule care secreta in mediu proteina himerica, identificata cu anti-corpi marcati Cy 5 (rosu). GFP este gena reporter ( verde).
